神经干细胞中PFK-1对神经发生的负调控作用

发布时间：2018-06-25 20:30

本文选题：PFK-1 + 神经发生　；参考：《南京医科大学》2016年博士论文

【摘要】：神经发生是指神经干细胞经历增殖及不对称分裂产生神经前体细胞,并向不同的功能性区域迁移、分化,最终整合进入神经环路中发挥生理功能的过程,也是成年大脑可塑性的意义所在。在成年哺乳动物的中枢神经系统中,神经发生主要存在于两个区域,即海马齿状回的颗粒细胞下层和侧脑室的室管膜下区。侧脑室室管膜下区的神经前体细胞经过增殖和分化,沿着嘴侧迁移流以链式模式迁移至嗅球并分化成为中间神经元；而海马齿状回下区的神经干细胞则经过短距离迁移至颗粒细胞下层分化为颗粒细胞,并通过苔藓纤维向海马CA3区发出轴突投射,建立突触联系,最终整合到海马神经环路中发挥学习记忆等功能。由于海马神经发生与学习、记忆和情感等高级认知功能密切相关,因此关于该区域神经发生及相关的分子机制在近些年来受到了广泛的关注和研究。磷酸果糖激酶-1(Phosphofructokinase-1,PFK-1)是糖酵解过程中重要的限速酶,主要通过磷酸化6-磷酸果糖生成ADP和1,6-双磷酸果糖,在无氧状态下为机体提供能量。以往研究证实PFK-1和肿瘤的发生发展过程密切相关,并有望成为肿瘤治疗的新靶点。在中枢神经系统中,PFK-1对星形胶质细胞及神经元的功能也发挥着不同的作用。然而,关于PFK-1和中枢神经系统中另一个细胞群,神经干细胞之间的联系则迄今未见研究报道。因此,本文展开了以下三方面的研究,第一：探究生理条件下,胚胎神经干细胞中PFK-1是否参与对神经发生的调节,且该调节作用是通过何种途径实现的；第二：探讨缺氧后PFK-1的表达变化及其对神经发生的影响；第三：阐释不同条件下PFK-1调节神经发生的分子机制。第一章生理状态下PFK-1对神经发生的调控作用为了探究生理状态下PFK-1对神经干细胞生物学行为的影响,本研究构建了两种慢病毒载体,分别携带PFK-1 shRNA和PFK-1基因全长以干扰和过表达PFK-1。将成功感染慢病毒的神经干细胞贴壁分化,4天后取出进行β-Ⅲ-Tubulin(神经元特异性标志物)的免疫荧光标记。结果显示,和LV-Control-shRNA组相比,LV-PFK-1-shRNA(干扰PFK-1表达)可显著促进神经干细胞向神经元的分化水平,增加新生神经元中多突起神经元的比例；相反,LV-PFK-1-GFP(过表达PFK-1)则逆转了这种神经元分化水平的升高趋势,多突起神经元分化比例也明显降低,这说明生理条件下,PFK-1是调节神经元分化及发育的重要分子。同时,结果显示干扰PFK-1表达后,巢蛋白Nestin+(神经干细胞标志物)细胞比例显著降低,增殖培养条件下的Nestin+细胞呈散在均匀的分布,而空病毒组细胞则趋向于呈神经球样聚集生长,这提示干扰神经干细胞中PFK-1的表达不利于其干细胞样特性的维持。以上结果证明,生理状态下PFK-1可负调控神经干细胞向神经元的分化和树突的发育,并参与干细胞样特性的维持。为了进一步证实PFK-1对神经干细胞的调节作用,本研究通过立体定位向小鼠海马齿状回区(Dentate gyrus, DG)微量注射慢病毒(LV-PFK-1-shRNA和LV-Control-shRNA),第4天腹腔注射BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)以标记新生细胞,第14天通过免疫荧光检测GFP/BrdU/DCX的表达。经分析发现和体外实验结果一致,与]LV-Control-shRNA相比,LV-PFK-1-shRNA可显著升高GFP+/BrdU+/DCX+新生神经元的比例,同时增加DG区GFP+BrdU+新生细胞数。上述结果表明,体内干扰PFK-1表达可促进神经前体细胞增殖,诱导神经干细胞分化为神经元。在以上整体动物实验中,慢病毒非特异性的感染DG区所有细胞(包括神经元、胶质细胞),可能对上述结果造成干扰。为了排除这种非细胞特异性感染带来的影响,本文统计了未被病毒感染的神经干细胞的神经发生水平。结果显示,GFP-/BrdU+/DCX+新生神经元比例及GFP-/BrdU+新生细胞数在两组间(LV-Control-shRNA和LV-PFK-1-shRNA)均无显著差异,提示这部分未被感染的神经干细胞的功能并未受周围因素(非细胞特异性的PFK-1干扰)的影响。因此可推断,这种非细胞特异性的感染并不影响以上干扰PFK-1表达促进神经发生的结果。以上结果已证实干扰PFK-1表达可促进神经发生,而引起神经发生增强的因素可能有三种,第一：促进神经元(前体细胞)的存活或降低其死亡率；第二：促进神经前体细胞增殖；第三：诱导神经干细胞向神经元方向分化。首先,为了确证干扰PFK-1表达所介导的神经发生是否通过作用于前两种因素实现的,本文将成功转染慢病毒(LV-Control-shRNA和LV-PFK-1-shRNA)的神经干细胞进行贴壁分化,并掺入BrdU和Hoechst分别标记增殖和死亡的细胞。结果显示和空病毒组相比,干扰PFK-1表达可显著增加BrdU+细胞比例,对细胞死亡率并无显著影响,说明干扰PFK-1表达可促进神经前体细胞增殖,但对细胞存活并无改善作用。其次,通过引入数学描述的方法分析第三个因素,即干扰PFK-1表达对神经干细胞命运选择的影响。假设分化过程中死亡的细胞全部都是神经元或全都不是神经元,可分别得到神经前体细胞(β-Ⅲ-Tubulin-)向神经元(β-Ⅲ-Tubulin+)分化的最小分化率(βmin)和最大分化率(βmax)。结果显示,和LV-Control-shRNA组相比,分化第四天LV-PFK-1-shRNA组神经干细胞向神经元的分化率(βmin和βmax)均显著升高。综合以上结果可知,干扰PFK-1表达可通过促进神经前体细胞增殖,诱导神经干细胞定向分化为神经元而促进神经发生,对细胞的存活并无显著影响。第二章缺氧状态下PFK-1对神经发生的调控作用本章研究主要探讨缺氧后PFK-1的表达变化及该条件下PFK-1对神经元分化水平的影响。结果显示,缺氧3 h、4h和5 h后神经干细胞中PFK-1的表达水平显著升高,并具有一定的时间依赖性,说明缺氧可促进PFK-1表达。此后,将缺氧5 h后的神经干细胞继续分化,4天后取出进行免疫荧光标记。结果显示,和Control组相比,缺氧后β-Ⅲ-Tubulin的阳性细胞率并无显著变化,这和生理条件下过表达PFK-1抑制神经元分化的现象并不一致。经分析可能是缺氧激活了某些调节神经发生的信号传导通路,从而拮抗PFK-1升高对神经元分化的抑制效应。此外,和空病毒组相比,缺氧状态下干扰PFK-1表达后,β-Ⅲ-Tubulin阳性细胞比例显著升高,新生神经元中多突起神经元的数目也明显增加,这提示缺氧后干扰PFK-1可促进神经干细胞向神经元的分化和树突的发育；而过表达PFK-1则逆转了这种现象。综上所述,缺氧后PFK-1可反向调控神经干细胞向神经元的分化,不利于神经元的发育。第三章PFK-1调节神经发生的分子机制本章在细胞水平上初步研究了不同条件下PFK-1调节神经发生的分子机制。首先,通过Western blotting法检测生理状态下分化6h后神经干细胞中Mash 1、NeuroD和Sox2的蛋白表达水平。结果显示,和LV-Control-shRNA相比,LV-PFK-1-shRNA可显著促进Mash 1、NeuroD和Sox2的表达,而这种现象可被过表达PFK-1所逆转,这提示Mash 1、NeuroD和Sox2可能参与了PFK-1所介导的神经发生过程。其次,对缺氧6h后的神经干细胞进行Western blotting分析发现,和生理状态下一致,干扰PFK-1后Mash 1、NeuroD和Sox2的蛋白表达水平均显著升高,而过表达PFK-1则降低了以上三种转录因子的表达水平。以上实验结果证明,Mash 1、NeuroD和Sox2可能参与了生理状态下及缺氧后PFK-1对神经发生的调节过程。最后,本研究探讨了PFK-1是否通过Wnt/β-catenin信号通路调节上述转录因子,进而调控神经发生,并最终证实PFK-1对神经发生的调节并不依赖于Wnt/β-catenin信号通路。综合以上结果可得到如下结论：(1)生理状态下,PFK-1可通过调节神经前体细胞的增殖及神经干细胞的命运选择而负调控神经发生。(2)缺氧后,PFK-1可负调控神经干细胞向神经元的分化及新生神经元的发育；(3)PFK-1对神经发生的调节可能是通过调节相关转录因子实现的。
[Abstract]:In the central nervous system of adult mammals , neurogenesis mainly exists in the central nervous system of adult mammals .
In the central nervous system , PFK - 1 and PFK - 1 play a different role in the development of astrocytes and neurons . However , in the central nervous system , PFK - 1 is closely related to the development of astrocytes and neurons , and it is expected to be a new target for tumor therapy .
Second : To investigate the expression of PFK - 1 after hypoxia and its effect on neurogenesis ;
In the first chapter , the effects of PFK - 1 shRNA and PFK - 1 gene on the biological behavior of neural stem cells were studied . The results showed that LV - PFK - 1 - shRNA ( interfering PFK - 1 expression ) could significantly promote the differentiation of neural stem cells to neurons and increase the proportion of multi - protruding neurons in neonatal neurons compared with LV - control - shRNA group .
The results showed that PFK - 1 could stimulate the proliferation of neural stem cells and induce neural stem cells to differentiate into neurons .
secondly , promoting the proliferation of the neural progenitor cells ;
The results showed that the expression of PFK - 1 and PFK - 1 increased significantly after hypoxia for 3 h , 4 h and 5 h .
In conclusion , the results showed that the expression of Mash 1 , NeuroD and Sox2 in neural stem cells could be regulated by Western blotting . The results showed that Mash 1 , NeuroD and Sox2 might participate in the neurogenesis induced by PFK - 1 .
( 3 ) The regulation of neurogenesis by PFK - 1 may be achieved by regulating the relevant transcription factors .
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q42

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