特异性定点共价固定化及酰基肽释放酶ST0779的非特异性催化的研究

发布时间：2016-12-10 08:29

本文关键词：特异性定点共价固定化及酰基肽释放酶ST0779的非特异性催化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

特异性定点共价固定化及酰基肽释放酶ST0779的非特异性催化的研究

李蓉

【摘要】：酶作为高效的生物催化剂在化工、食品、医药、环境治理和检测等领域得到了广泛的应用。但是酶制剂存在着活性不稳定、回收利用率差，容易受到外界因素如温度、pH值等的影响而失活等问题而使其应用受到了许多限制。酶固定化技术可以克服酶制剂在应用中稳定性差、重复利用率低等问题，因此越来越受到重视。目前酶的固定化方法可分为非特异性固定化和特异性固定化。其中特异性固定化是通过对酶进行合理的设计和改造向酶蛋白中引进一些特殊的功能团，利用这些功能团可以使酶与载体进行特异性定点结合。此方法因可以针对性地提高酶活性、稳定性或增强催化特异性而成为当前的研究热点。本文采用特异性定点共价固定化方法进行研究。通过对酶进行合理的设计和改造，向酶蛋白中引入特异性反应功能团——醛基，并利用此功能团定点与氨基载体进行共价固定化。此方法不仅可以通过合理地设计与选择对进行酶有针对性的固定化，同时形成的共价键使酶与载体之间的固定更加牢固，不易脱落。我们利用甲酰甘氨酸生成酶（FGE）能够识别硫酸酯酶序列中高度保守序列LCXPXR，并可以催化其中的半胱氨酸转化成含有一个醛基的甲酰甘氨酸（FGly）的特性。将这六个保守序列通过基因工程引入目标酶的蛋白氨基酸中，使目标蛋白经FGE的催化修饰带有特异性的醛基功能团，从而获得含有醛基标签的重组酶蛋白。以商用质粒载体pET-28a为改造骨架，将其用于纯化表达的组氨酸标签（组氨酸标签）替换为醛基标签（醛基标签），成为具有通用性的可以用于构建含有特异性醛基标签的重组蛋白表达载体。并且利用质粒载体pET-28a在位于多克隆位点的N、C端分别含有一个组氨酸标签的特点，我们构建了四个表达载体亚型：无组氨酸标签的pET-28aDH、N端含有醛基标签的pET-28aNQ、C端含有醛基标签的pET-28aCQ以及两端均含有醛基标签的pET-28aDQ。之后选用了4个不同来源的酶作为模式酶来构建含有醛基标签的酶，分别为嗜热酰基肽释放酶ST0779、嗜热酯酶APE1547、嗜热脱氯酶ST2570以及脂肪酶LipA，并对不同位置引入醛基标签对酶蛋白的表达和酶活的影响进行了系统研究。研究结果在蛋白的N、C端分别引起醛基标签，其目的蛋白表达量及酶活力均受到不同程度的影响；而两端同时引入醛基标签，对蛋白的表达及酶活力都出现大幅度下降。同时对修饰后的酶进行了固定化研究，测定酶固定化效率、稳定性以及回收利用率。结果显示，固定化的稳定化有所提高，固定化过程中有针对性无醛基标签蛋白不能固定于载体上。一直以来酶都被认为是具有专一性、特异性，只对一类反应具有高度识别性的生物催化剂，但是最近一些研究发现一些酶能够利用主反应的活性位点催化不同于其主要酶活性反应，即为酶的催化非特异性。此特性不仅拓展了酶促有机合成的反应类型，提高了酶在有机合成领域的应用价值，同时也对研究不同酶的进化关系提供重要的线索。其中研究最为广泛的是来自/β水解酶家族一类丝氨酸水解酶，可催化C-C和C-N键形成的反应。嗜热酰基肽释放酶ST0779属于/β水解酶家族，其催化三联体与脂肪酶的催化三联体相一致，我们推测其也可能具有酶的催化非特异性特性。本论文首次尝试研究并发现ST0779可以进行非特异性催化aldol反应。脂肪酶PPL是目前研究报道中非特异性催化aldol反应效果最好的酶。因此我们用脂肪酶PPL作为对照来比较反应速率、产率以及产物的立体选择性。实验发现，以4-对硝基苯甲醛和丙酮为底物，在55℃下ST0779催化4h即可达到96.1%的转化率。而PPL在30℃催化48h才达到39.2%的转化率，ST0779的非特异性催化aldol反应效率要高于目前已报道过的酶非特异性催化aldol反应效率。为了更好的理解ST0779和PPL非特异性催化aldol反应机理，我们通过荧光光谱来研究底物分子丙酮、对硝基苯甲醛与酶分子之间相互作用。通过分析得到底物与蛋白的结合常数、结合位点以及结合力类型，结合酶分子结构来解释ST0779非特异性催化aldol反应的机制。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q814.2
【目录】：

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1 张勇,张贵珠,王月梅,卢继新;光谱法研究丝裂霉素、血清白蛋白以及金属离子间的相互作用[J];分析科学学报;2000年06期

2 邓世星;杨季冬;;荧光法研究牛血清白蛋白与中性红的相互作用[J];分析科学学报;2007年02期

3 李建晴;朱海斌;卫艳丽;;可可碱与牛血清白蛋白作用光谱特性的研究[J];分析科学学报;2009年03期

4 ;Expression and Characterization of a Thermostable Acyl-peptide Releasing Enzyme ST0779 from Sulfolobus tokodaii[J];Chemical Research in Chinese Universities;2012年05期

5 ;Study on a Specific Site Tyr~(444) on a Hyperthermophilic Enzyme APE1547[J];Chemical Research in Chinese Universities;2009年03期

6 王守业,徐小龙,刘清亮,解永树;荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用[J];化学进展;2001年04期

7 李存存;张光亚;;酶定向固定化方法及应用的研究进展[J];化工进展;2013年10期

8 ;Archaeal acylamino acid releasing enzyme/lipase:Crystallization and preliminary crystallographic analysis in a new crystal form[J];Chinese Science Bulletin;2003年02期

9 赵博;高仁钧;廉虹;曹淑桂;;枯草杆菌脂肪水解酶LipA和LipB[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年05期

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1 刘畅;蛋白质工程和溶剂工程改变嗜热酯酶的底物特异性和活性[D];吉林大学;2011年

2 赵博;定向进化及定点突变提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力和立体选择性[D];吉林大学;2009年

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1 陈兰英,赵桢,王晓涛,屈二军,陈建南;HSP70基因在人胃癌、食道癌及宫颈癌中高表达和癌变关系的研究[J];癌变.畸变.突变;2005年04期

2 程烽;盛燕;施静艺;陈漪;徐潮;刘智;梁军;潘春明;朱忠勇;宋怀东;;重叠延伸PCR法构建UGRP1基因启动子的点突变表达载体[J];癌变.畸变.突变;2007年01期

3 温居一;张积仁;李鹏;张军;王斌;;NADH对二乙基亚硝胺所致L02人肝细胞株p53基因突变和c-erbB2基因表达的影响[J];癌变.畸变.突变;2009年05期

4 金艺凤;李铁臣;王莹;刘东华;孙珍贵;;ERCC1和XPD单核苷酸多态性与非小细胞肺癌铂类化疗敏感性的关系[J];癌变·畸变·突变;2010年05期

5 王继英;武英;郭建凤;呼红梅;张印;;莱芜黑猪保种群促卵泡素β亚基和雌激素受体基因、基因型变化情况[J];山东农业科学;2007年01期

6 陈静;胡晓辉;苗华荣;张建成;禹山林;;花生SRAP-PCR技术体系的优化[J];山东农业科学;2008年05期

7 陈长宝;朱树华;周杰;;改良CTAB法提取成熟肥城桃果实的总RNA[J];山东农业科学;2009年05期

8 葛宏华,肖亚中,姚建平;人心室肌球蛋白轻链1基因的克隆及其体外的表达与纯化[J];安徽大学学报(自然科学版);2004年06期

9 侯新东;盛桂莲;张桦;腊萍;;质粒DNA提取方法的探讨[J];安徽农学通报;2006年13期

10 朱美霞,孟艳玲,陈良兵;大豆与棉花抗性基因类似物的同源性比较及其进化分析[J];安徽农业科学;2005年02期

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1 朱林;江昌俊;叶爱华;李叶云;余梅;邓威威;;茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年

2 徐波;张莉;李启云;王景会;姜媛媛;杨贞耐;;牛凝乳酶成熟肽基因在大肠杆菌中的表达[A];中国奶业协会年会论文集2008（下册）[C];2008年

3 刘冬光;廖娟红;于清龙;陈颖钰;陈焕春;郭爱珍;;融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用[A];中国奶业协会年会论文集2009（上册）[C];2009年

4 张海龙;田兆丰;董志;张晏如;张飞云;;多花黑麦草斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达[A];2010植物免疫机制研究及其调控研讨会论文集[C];2010年

5 闫云君;蔡勇;杨江科;;基于易错POR技术的短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)脂肪酶YZO2的定向进化[A];节能环保和谐发展——2007中国科协年会论文集（一）[C];2007年

6 李玫;廖宝文;;红树林湿地烷烃降解菌的分离筛选[A];第十三届中国科协年会第16分会场-沿海生态建设与城乡人居环境学术研讨会论文集[C];2011年

7 郭奕斌;陈路明;孟亚仙;王晶晶;杜传书;潘敬新;;一个广东四川家庭的IDS基因新突变[A];第六届全国优生科学大会论文汇编[C];2006年

8 于占东;赵双宜;何启伟;王翠花;牟晋华;刘春香;;抗芜菁花叶病毒转基因大白菜的研究[A];中国园艺学会第十届会员代表大会暨学术讨论会论文集[C];2005年

9 龚束芳;杨涛;车代弟;;偃麦草根茎非质体蛋白质修饰冰晶能力的观察[A];2007年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集[C];2007年

10 王英;滕齐辉;曹慧;胡锋;崔中利;;淹水和旱作水稻土中细菌群落多样性的空间分布[A];第四次全国土壤生物和生物化学学术研讨会论文集[C];2007年

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1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年

2 殷慧群;猪诱导性多潜能干细胞的建立[D];安徽农业大学;2010年

3 杨瑞梅;单链抗体介导狂犬病毒shRNA靶向制剂的研究[D];甘肃农业大学;2010年

4 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年

5 阎金勇;白地霉脂肪酶的制备、修饰改良及应用研究[D];华中科技大学;2010年

6 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年

7 生书晶;何首乌芪合酶基因（FmSTS）的克隆、鉴定及转化拟南芥研究[D];华南理工大学;2010年

8 单海霞;新型烷基咪唑离子液体的合成及应用[D];江南大学;2010年

9 梁东;苹果山梨醇代谢相关基因的分子特性研究[D];西北农林科技大学;2010年

10 朱彦涛;甘蓝型油菜Polima CMS和陕2A CMS的形态和生化特征及其胞质遗传物质的比较研究[D];西北农林科技大学;2010年

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1 高红梅;ETEC对断奶腹泻仔猪胃肠道紧密连接蛋白ZO-1的影响[D];华中农业大学;2010年

2 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年

3 汪艳杰;水稻polycomb基因家族甲基化状态初步检测[D];华中农业大学;2010年

4 王伟;恶臭假单胞菌表面展示细菌漆酶及对染料的脱色性能[D];华中农业大学;2010年

5 黄辉;哈维弧菌表面抗原的克隆和真核表达[D];华中农业大学;2010年

6 段龙川;产毒素多杀性巴氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2010年

7 龚瑞;粘附素ClfA和Cna对金黄色葡萄球菌乳腺炎的免疫保护研究[D];华中农业大学;2010年

8 刘源;猪胸膜肺炎放线杆菌双组分调控系统ΔnarQ/narP突变株构建及功能研究[D];华中农业大学;2010年

9 李善文;蟾蜍灵对大鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响[D];南京医科大学;2009年

10 辛宁;PDX-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达[D];郑州大学;2010年

【二级参考文献】

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1 ;Effect of Calcium Cation on Thermophilic Acylamino Acid-releasing Enzyme Ape1547 from Aeropyrum pernix K1[J];Chemical Research in Chinese Universities;2009年04期

2 ;Computational Investigation on the Ethylene-induced Esterase from Citrus Sinensis[J];Chemical Research in Chinese Universities;2010年01期

3 陈真龙，张利民，丁兰，余华明,赵大庆，，王守业，刘清亮;皖南尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒出血毒素Ⅲ(AaHⅢ)的荧光淬灭研究[J];化学物理学报;1998年05期

4 马贵斌,高飞,任斌知,杨频;荧光法研究药物分子与人血清白蛋白的结合作用[J];化学学报;1995年12期

5 鄢远,许金钩,陈国珍;三维荧光光谱法研究蛋白质溶液构象[J];中国科学(B辑化学);1997年01期

6 杨曼曼,杨频,张立伟;荧光法研究咖啡酸类药物与白蛋白的作用[J];科学通报;1994年01期

7 杨斌盛,杨频;人血清白蛋白与金属离子作用的荧光光谱研究[J];生物化学与生物物理进展;1992年02期

8 王守业,张祖德,陈真龙,余华明,吴双顶,刘清亮;皖南尖吻蝮蛇蛇毒纤溶组分中结合态钙的生化特性[J];生物化学与生物物理学报;1998年03期

9 韩国柱;刘云海;;药物-血浆蛋白结合与药物动力学[J];生理科学进展;1987年03期

10 曹黎明,陈欢林;酶的定向固定化方法及其对酶生物活性的影响[J];中国生物工程杂志;2003年01期

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1 王秋岩;蛋白质半合理设计改变古菌Aeropyrum pernix K1酰基氨酰肽酶/酯酶的底物特异性[D];吉林大学;2006年

2 张桂荣;嗜热酯酶APE1547的立体选择性研究[D];吉林大学;2006年

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1 张爱军;超嗜热酯酶APE1547突变体的结构和酶学性质的研究[D];吉林大学;2005年

2 王莹;溶剂效应的量子化学研究[D];四川大学;2006年

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