Argonaute2蛋白的泛素化调控

发布时间：2018-07-17 21:26

【摘要】：目的:RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种细胞在进化过程中保留的在转录后水平对基因表达进行沉默或抑制的调控方式。RNAi作用广泛存在于真核细胞中。在真核细胞中,RNAi过程主要由小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和微小RNA(microRNA,mi RNA)介导完成。siRNA或miRNA识别并结合Argonaute 2(Ago2)蛋白后形成RNAi的效应器—RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)。RISC介导siRNA或miRNA对于靶mRNA的识别及切割,在RNAi过程中发挥了至关重要的作用。因此RISC的核心组分Ago2蛋白被称为RNAi装置的催化引擎。因此对于核心分子Ago2的调控研究有助于深入了解RNAi的作用过程。本实验室前期工作中,通过酵母双杂交系统筛选出了Ago2的相互作用蛋白26S蛋白酶体ATP酶亚基3(PSMC3)和RBBP6。并证实了PSMC3可以通过泛素化-蛋白酶体途径依赖的方式调节Ago2蛋白的稳定性,然而具体的分子机制尚不明确。本课题拟从泛素化角度展开PSMC3和RBBP6蛋白对Ago2蛋白的稳定性调控机制的研究。方法:首先,我们利用溶酶体及蛋白酶体抑制剂处理细胞,检测Ago2蛋白水平及泛素化水平的变化。然后,通过检索BioGRID数据库选定PSMC3可能的相互作用分子USP14为候选研究对象。其后,我们通过免疫共沉淀实验、免疫荧光结合共聚焦显微镜采集图像分析、放线菌酮实验、Western blot及免疫沉淀等实验验证了PSMC3为USP14的相互作用蛋白并且Ago2是USP14的作用底物且USP14可以调控Ago2的泛素化水平。随后,通过构建USP14的不同突变体并结合免疫共沉淀分析确定了USP14与Ago2及PSMC3相互作用的结构域;通过Western blot实验确定了PSMC3对于Ago2的稳定作用依赖于USP14。同时,我们通过免疫共沉淀实验初步验证了RBBP6与Ago2蛋白的相互作用,并通过Western blot实验确定了RBBP6可以促进Ago2蛋白的泛素化并增强Ago2的降解。最后,通过Western blot实验确定了RBBP6,PSMC3及USP14对于RNAi作用的影响。结果:蛋白酶体抑制剂可以促进泛素化的Ago2蛋白在体内的累积。USP14可以分别与PSMC3及Ago2相互作用。干扰USP14可以明显缩短Ago2蛋白的半衰期。USP14特异性抑制剂能够促进泛素化的Ago2在细胞内累积。USP14可以调控Ago2蛋白的水平且MG132使得此调控作用消失。确定了USP14分别与PSMC3及Ago2相互作用的最小结构域。RBBP6与Ago2相互作用。RBBP6可以调控Ago2蛋白的水平且MG132使得此调控作用消失。RBBP6,PSMC3及USP14表达水平的改变可以影响RNAi的干扰效率。结论:本研究揭示了Ago2蛋白泛素化及去泛素化的调控过程。确定了USP14对于Ago2的去泛素化调控并抑制其随后在26S蛋白酶体中的降解,并且证明PSMC3可以促进此调控过程。同时初步确定了RBBP6促进Ago2泛素化的作用。
[Abstract]:Objective: RNA interference (RNA interference) is a kind of regulation of gene expression silencing or inhibition at post-transcriptional level reserved by cells during evolution. RNAi is widely used in eukaryotic cells. In eukaryotic cells, the RNAi process is mainly mediated by small interfering RNAs (small interfering RNAs siRNAs) and microRNAs (microRNAs miRNAmiRNAs) mediated by. SiRNAs or miRNAs are recognized and combined with Argonaute 2 (Ago2) proteins to form RNAi effectors-RNA-induced silencing complexRISC .RISC mediated siRNAs or miRNAs to recognize and dissect target RNAs. It plays an important role in the RNAi process. Therefore, the core component of RISC Ago2 protein is called the catalytic engine of RNAi device. Therefore, the study on the regulation of the core molecule Ago2 is helpful to further understand the process of RNAi action. The interacting protein 26S proteasome ATPase subunit 3 (PSMC3) and RBBP6 of Ago2 were screened by yeast two-hybrid system. It is confirmed that PSMC3 can regulate the stability of Ago2 protein by Ubiquitin proteasome pathway dependent manner, but the specific molecular mechanism is not clear. The aim of this study was to investigate the mechanism of stability regulation of PSMC3 and RBBP6 proteins on Ago2 proteins from the perspective of ubiquitization. Methods: firstly, we treated cells with lysosome and proteasome inhibitors to detect the changes of Ago2 protein and ubiquitin level. Then, the possible interaction molecule USP14 of PSMC3 was selected as candidate by searching BioGRID database. Then, through the co-immunoprecipitation experiment, the immunofluorescence and confocal microscope were used to collect and analyze the image. Western blot and immunoprecipitation experiments confirmed that PSMC3 is the interacting protein of USP14 and Ago2 is the substrate of USP14, and USP14 can regulate the level of ubiquitin of Ago2. Then, the domain of interaction of USP14 with Ago2 and PSMC3 was determined by constructing different mutants of USP14 and combining with immunoprecipitation analysis, and the stability of PSMC3 to Ago2 was determined by Western blot experiment. At the same time, the interaction between RBBP6 and Ago2 protein was preliminarily verified by immunoprecipitation, and it was confirmed by Western blot that RBBP6 could promote the ubiquification of Ago2 protein and enhance the degradation of Ago2. Finally, the effects of RBBP6 PSMC3 and USP14 on RNAi were determined by Western blot. Results: proteasome inhibitor could promote the accumulation of ubiquitin Ago2 protein in vivo. USP14 could interact with PSMC3 and Ago2 respectively. Interfering with USP14 could significantly shorten the half-life of Ago2 protein. USP14-specific inhibitor could promote the accumulation of ubiquitin Ago2 in cells. USP14 could regulate the level of Ago2 protein and MG132 could make this regulation disappear. It was determined that the minimal domain of USP14 interacting with PSMC3 and Ago2. RBBP6 interacting with Ago2 could regulate the level of Ago2 protein, and MG132 could make this regulation disappear. The change of expression level of PSMC3 and USP14 could affect the interference efficiency of Ago2. Conclusion: this study revealed the regulatory process of Ago2 ubiquitization and deubiquification. The regulation of USP14 on the deubiquification of Ago2 and its subsequent degradation in 26s proteasome were determined, and PSMC3 was proved to facilitate this process. At the same time, the role of RBBP6 in promoting the ubiquitin of Ago2 was preliminarily confirmed.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q75

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本文编号：2130987