谷胱甘肽过氧化物酶突变体及其模拟物的表达与表征

发布时间：2016-12-15 23:15

  本文关键词：谷胱甘肽过氧化物酶突变体及其模拟物的表达与表征，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

谷胱甘肽过氧化物酶突变体及其模拟物的表达与表征

郭笑  

【摘要】：活性氧（ROS）是生物体代谢过程中产生的一类含氧原子的总称，主要包括超氧阴离子（O2·-）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）及脂质过氧化的不稳定中间体等。正常生理状态下，ROS的产生和消除处于动态平衡状态。然而多种内在及外在因素都会导致ROS的过量产生，当过多的ROS不能及时清除时则会产生一系列负面影响，进而诱发多种疾病，如癌症、心脑血管疾病、帕金森疾病、糖尿病以及肥胖等。生物体在进化过程中产生了完整的酶类及非酶类抗氧化系统对抗ROS。其中抗氧化酶类主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和GPx。 高活性的GPx大部分为含硒酶，其催化活性中心Sec由通常作为终止密码子的UGA编码，因此Sec掺入到蛋白质中需要一种特殊机制。然而真核生物和原核生物Sec的插入机制并不相同，很难利用传统的基因重组技术在E. coli中大量表达含硒GPx。基于GPx表达的特殊性及其功能的重要性，科学家们制备出多种GPx模拟酶，但得到的模拟物大多存在活性低、制备方法复杂、产量低以及可溶性差等问题。 Cys缺陷表达系统是制备含硒蛋白的一种有效方法，其原理是利用Cys转运RNA（tRNACys）能够结合Sec的特点，用缺少Cys而富含Sec的培养基培养菌种，从而使Sec掺入到新生蛋白质中。SPP表达系统是近年来发展起来的一种高效表达重组蛋白的方法，该系统可以在保证蛋白产量的前提下，通过浓缩培养基降低制备成本。因此，联合使用Cys缺陷表达系统和SPP系统，可以有效提高重组硒蛋白的生产效率。基于此本研究制备了一系列具有较高活力的hGPx1和hGPx2突变体，结合计算机辅助模拟蛋白质结构对其结构与功能间的关系进行研究。通过对hGSTZ1c-1c蛋白进行改造，得到了具有明显GPx活力的seleno-hGSTZ1c-1c突变体，并对其催化中心——SSC基序的作用进行了讨论。 （1）重组含硒hGPx1突变体的异源表达与表征 GPx1是首个被发现的硒蛋白，广泛存在于人体红细胞、肾及肝脏等组织中，在保护机体免受氧化损伤中发挥着重要作用。本研究首先从人肝癌细胞株HepG2的cDNA文库中调取hGPx1的基因。然后将编码Sec-49的密码子UGA突变为编码Cys的密码子UGC，再通过Cys缺陷表达系统将其替换为Sec，得到的seleno-hGPx1Sec突变体活力为522U/μmol。利用该方法制备硒蛋白会将蛋白骨架中所有Cys非特异的取代为Sec，而影响重组蛋白的活力。考虑到Ser与Cys的理化性质及分子结构最为接近，于是利用快速定点突变将hGPx1蛋白骨架中含有的五个Cys突变为Ser。结果得到的seleno-hGPx1Ser突变体活力（5278U/μmol）较突变前提高了9倍，该活力在目前所有利用此方法制备的GPx相关蛋白中最高，，它甚至可与天然牛肝GPx（2084U/μmol）、兔肝GPx（5780U/μmol）相媲美。酶促反应动力学研究表明，该突变体的催化机制同天然GPx相同，均为乒乓机制。该研究一定程度上解决了天然GPx来源有限的问题，同时有助于我们今后对天然hGPx1催化机理的进一步研究及认识。 （2）高活力含硒hGPx1突变体的制备及其结构与性质的研究 为了进一步研究hGPx1结构与性质之间的关系，本研究利用快速定点突变依次将hGPx1中的Cys-2, Cys-78, Cys-115, Cys-156, Cys-202突变为Ser，并联合使用SPP系统和Cys缺陷表达系统对上述hGPx1突变体进行表达。实验结果显示这些突变体的活力随蛋白质内非催化Sec数目的减少，其催化活力逐渐提高，当hGPx1中所有Cys均被突变为Ser后，得到突变体seleno-hGPx1-C2/78/115/156/202S的活力最高，为21268U/μmol，该活力约是天然牛GPx1活力的10倍。与此同时，利用计算机辅助模拟对突变体蛋白质结构进行了分析，结果发现催化三联体中Sec与底物GSH间的距离对催化效率有很大影响，距离近则有助于催化反应进行，距离远则反之。进一步证实了用该系统制备硒蛋白时，将Cys突变为Ser可以减少Sec非特异性取代对蛋白质结构及活性产生的负面影响，进而提高催化能力，这对今后hGPx1结构及催化机制的研究奠定了良好的基础。此外，与单独使用缺陷表达相比，该方法的不仅可以增加蛋白产率、降低生产成本，而且很大程度上提高了蛋白活力。 （3）含硒hGPx2突变体的制备及其结构与性质的研究 胃肠道GPx（GPx2）被认为是抵抗由饮食摄入氧化剂或肠道微生物氧化压力的第一道防线。为了使用SPP系统和Cys缺陷表达系统制备具有活力的重组seleno-hGPx2突变体蛋白，首先对hGPx2基因进行设计，将编码催化基团Sec-40的密码子改为编码Cys的密码子；同时将编码Cys残基的密码子改为编码Ser残基的密码子。得到的seleno-hGPx2突变体活力与天然hGPx4在同一数量级，但比天然hGPx1低一个数量级。对其酶促反应动力学研究发现，该酶的催化机制与天然GPx相同为乒乓机制。由于目前仍没有对纯化后GPx2活力及相关动力学常数的报道，该研究对天然GPx2的认识具有重要意义。此外，对seleno-hGPx2突变体结构的模拟有助于我们今后对GPx2功能及性质的研究。（4）基于定点突变研究Seleno-hGSTZ1c-1c的催化活性 人Zeta型谷胱甘肽硫转移酶1c-1c (hGSTZ1c-1c)具有GSH结合位点，被视为模拟GPx的理想骨架蛋白。为了获得具有GPx活力的模拟酶，首先将hGSTZ1c-1c非催化中心的Cys-137、Cys-154、Cys-165和Cys-205突变为Ser，然后分别将催化中心的14、15及17位三个氨基酸残基突变为Cys，再利用Cys缺陷型大肠杆菌表达系统将其特定地转化为Sec，即把GPx的催化基团引入到hGSTZ1c-1c中。其中制备的seleno-hGSTZ1c-1c-15C、14C/15C和17C三个含硒突变体具有一定的GPx活力，取得了突破性进展。对非含硒突变体性质研究发现，Ser-14或Ser-15任何一个残基发生突变都会导致hGSTZ1c-1c的GST活力几乎丧失，这表明Ser-14、Ser-15在催化反应中发挥着重要作用，但前者主要是与底物结合，后者更侧重于催化。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

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