基于原子力显微镜的单分子力谱对蛋白质的研究

发布时间：2016-12-16 08:00

  本文关键词：基于原子力显微镜的单分子力谱对蛋白质的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

《南京大学》 2015年

基于原子力显微镜的单分子力谱对蛋白质的研究

高翔  

【摘要】：蛋白质是一类非常重要的生物大分子,在物质代谢、细胞信息传递、个体生长发育等方面均有不可替代的作用。单分子力谱被广泛地用于表征蛋白质在其生理环境下的构象变化,从而研究机械力对结构和功能的调控作用。一方面,为了行使蛋白质的正常生物功能,蛋白质需要和多不同的配体蛋白相互作用,并在作用过程中发生变构以实现其功能或者将信号传递出去。蛋白质和配体结合过程中会在相互作用表面发生形变以适应它的配体,因此蛋白质的柔性是蛋白和配体结合中一个很重要的因素。我们研究了一种可以和多个配体结合的蛋白ARNT PAS-B,发现其柔性非常强,蛋白的N端和C端在存在拉力的时候距离可以增加75%,而蛋白本身不发生解折叠,这一发现可以解释PAS-B和不同配体结合的机理,另外,我们还发现了该蛋白在力学解折叠过程中存在一个短暂的中间态,蛋白的力学解折叠过程将沿着两态或者三态过程发生,解折叠过程中存在动力学分配的行为。另一方面,许多生物大分子通过机械力来调控其结构与生物功能。它们能够产生,感应,传递和响应力学信号,并且做出相应的构象变化。除了蛋白和蛋白相互作用产生的拉力,含有多个结构域的蛋白内部也存在张力,这样一种张力是否在会影响蛋白质动力学和功能目前还不清楚。我们对人体内凝溶胶蛋白进行了单分子力谱测量,发现凝溶胶蛋白在拉力作用下对钙离子的结合强度大幅度增加,当拉力仅为十皮牛时解离常数降低了六倍。凝溶胶蛋白在去激活态时内部不同结构域之间可能存在张力,我们推测,正是由于这种力学加强的配体结合机理和蛋白内部结构域间的张力增加了凝溶胶蛋白的激活过程中的协同性。本论文主要内容如下：第一章主要介绍了单分子力谱的发明发展和工作原理,简单回顾了蛋白质的折叠动力学以及力学信号对蛋白质功能的影响。并介绍了单分子力谱的数据处理方法和一些常用的模型。然后我列举了一系列优秀的单分子力谱的工作,回顾了单分子力谱研究的发展。第二章主要内容为：对人体内芳烃受体核转运蛋白(ARNT) PAS-B结构域的单分子力谱工作。PAS (Per-ARNT-Sim)结构域是一个存在于信号传导蛋白中的可以和多种配体结合的蛋白模体。它可以对非常多的化学和物理信号进行相应。虽然它的功能多样,但是PAS结构域有相对保守的结构。有研究推测PAS结构域是柔软的,所以可以适应不同的结合配体。但是,目前为止还没有对PAS结构域柔性的直接测量结果。这里,我们使用单分子原子力显微镜定量测量了一种PAS结构域,ARNT PAS-B,的力学解折叠。我们的力谱数据显示ARNT PAS-B结构域可以被小于30 pN的拉力解折叠,如此小的解折叠力是源自其较宽的解折叠势井,其解折叠势井的宽度大约为2 nm。这个性质将允许PAS-B结构域的N端和C端在受力的时候被拉伸75%,而自身不发生解折叠。另外,我们发现ARNT PAS-B结构域通过一种动力学分配机(kinetic partitioning mechanism)沿着两条不同的路径解折叠。百分之六十七的ARNT PAS-B蛋白沿着一条较简单的两态路径发生解折叠,而另外的百分之三十三在解折叠时则会首先到达一个结构确定的中间态,该中间态是折叠态蛋白的C端发卡结构打开产生的。我们猜想PAS-B结构域的这种结构柔性和力引发的部分解折叠现象可能提供一种特别的配体招募机制,以招募多种多样的配体分子,并降低其配体结合表面(binding surface)构象变化的自由能垒。第三章主要内容为：单分子力谱实验揭示出凝溶胶蛋白的钙离子结合的力学增强效应。越来越多的人意识到力在生物过程中起到非常重要的作用。力可以解折叠天然态蛋白质,导致蛋白质特有的力学响应。蛋白-蛋白结合亲和性可能会降低,或者在拉力作用在其中一个或者两者之上时,导致新的蛋白-蛋白相互作用位点被暴露出来。这里我们的实验证明,凝溶胶蛋白(gelsolin)的第六个结构域(G6)可以在机械力作用下提高其与钙离子的亲和性。我们的动力学模型表明G6蛋白的钙离子亲和性随着拉力的增加而呈指数性的增长,这种增长将一直持续到G6蛋白发生力学解折叠。这表明在拉伸力存在时,凝溶胶蛋白可能在更低的钙离子水平下被激活。这种阳离子-蛋白结合亲和性受力学调控的结论提供给我们在有应力的细胞环境中,比如细胞骨架丰富的区域或者细胞粘附区域,阳离子调控蛋白的复合体行为一种新的理解。第四章的主要内容为：我们通过原子力显微镜对配体调控的SH3蛋白的力学各向异性进行了研究。我们已经知道,力在生物过程中起到不可缺少的作用。力可以引起蛋白质的构象变化,可以导致蛋白的力学解折叠以及各种各样效应。随着单分子力谱技术的发展,我们可以详细的研究蛋白质分子的的力学性质。尤其是随着半胱氨酸对交联技术(double-cysteine crosslinking method)的发明,力可以施加在蛋白的各个方向。有研究表明,蛋白质的力学稳定性是各向异性的,依赖于施加力的方向。同时,也有研究表明配体结合可以有效的增加蛋白的稳定性。但是,目前仍然缺少配体调控的稳定性在不同拉伸方向上产生的效果的研究。这里,我们通过基于原子力显微镜的单分子力谱研究了SH3各项异性对拉伸方向的响应。我们发现在几个拉伸方向上,配体对SH3蛋白的影响各不相同,并且和最开始的力学稳定性无关。在400nm/s的拉伸速度下,解折叠力的增加从5%到80%不等。更加细节的研究表明给出了如下结论：第一,为了使蛋白可以在不同拉伸方向下进行研究,我们的突变将导致配体无法和蛋白结合,这就导致了蛋白在加入配体之后解折叠力不发生变化。二,配体和蛋白结合之后稳定性都会增加,但是增加的稳定性和原本的稳定性无关,只和位置有关。三,蛋白质的解折叠距离不发生变化,也就是说蛋白的解折叠路径没有发生变化。这些发现提供了我们对力学调控和配体调控的耦合的生物学过程提供了新的理解。第五章我总结博士生期间的工作,给出了将来的研究计划。

【关键词】：
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51
【目录】：

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