利用基因组编辑技术针对猪H11位点的高效定点整合系统的研究

发布时间：2016-12-26 16:47

  本文关键词：利用基因组编辑技术针对猪H11位点的高效定点整合系统的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《吉林大学》 2015年

利用基因组编辑技术针对猪H11位点的高效定点整合系统的研究

阮进学  

【摘要】：转基因猪在农业与医学研究中发挥着重要的作用。一方面猪作为一种重要的畜牧用物种，转基因猪在肉质的改良，生产性能的改进，抗病育种上的应用与环保育种的改善上起着关键的作用；另一方面，猪与人相对于人与小鼠等其他动物更为接近，转基因猪在医学研究上也发挥着不小的作用，比如猪与人的器官大小接近，这一点使异种移植成为了可能，再者猪与人的各器官的结构与血液生理生化指标相似，转基因猪成为更好的动物模型，其在异种移植、糖尿病、动脉粥样硬化、老年痴呆症等医学领域都有着较多的应用。 尽管转基因猪的在很多领域已经得到应用，然而却依然受到一定的限制，转基因的效率与整合位点的不确定性是主要原因。为了解决这一问题，2014年赖良学课题组针对猪开发了Rosa26位点，他在其中引入了loxp位点，，并成功将RFP基因置换进入并成功表达，使外源基因能在该位点高效表达。但是Rosa26是一个全身性表达的友好性基因，具有自己的Rosa26启动子，在该位点插入的基因往往会导致基因在全身性的广泛表达，然而实际转基因技术的运用中往往仅仅需要组织特异性表达，该位点很难实现。 2010年，斯坦福大学的Simon Hippenmeyer及其研究团队在小鼠的第11号染色体上分离并鉴定出了一个良好的基因插入位点，命名为hipp11位点，简称H11位点。H11位点位于Eif4enif1与Drg1两个基因的间隙，与Eif4enif1基因的19号外显子和Drg1基因的9号外显子相邻，大小约5kb。H11位点由于位于两个基因之间，因此安全性较高，无基因沉默效应，具有广谱的细胞表达活性。 本实验室根据人与小鼠寻找H11位点的经验，在猪的第14号染色体鉴定出H11位点，并在5个猪品种中初步排除了SNP位点，其后对其进行了初步分析。为了能够将外源基因高效的放入该位点中，我们采用了新型的基因编辑技术，针对猪的H11位点，H11位点设计了5对TALEN，1对CRISPR/Cas9n与2条CRISPR/Cas9，通过T7EI酶切法与测序法对他们的效率验证，我们发现CRISPR/Cas9的切割效率最高，通过测序验证，Cas9-H11-g1切割效率达到了64%，之后根据2条CRISPR/Cas9的序列在猪的基因组中一共预测了23个可能的脱靶位点，经过T7EI酶切验证，没有脱靶的现象发生。 其后我们根据筛选方法设计了2种打靶载体，分别利用正负筛选法，正筛选法与无药物筛选法完成了细胞筛选，意在找到一种最高效的筛选方法。通过这三种筛选方法均筛选到阳性克隆，其中正负筛选法的效率为23%，正筛选的效率为54%，无药物筛选的效率达到了6%，经过比较发现通过正筛选法效率最高。 为了验证插入猪H11位点的基因能否高效的表达，我们以GFP为报告基因，并以CMV启动子启动该基因，结果显示所有的阳性克隆均能够高效的激发绿色荧光，且在利用该细胞制备胚胎后也能激发绿色荧光。其后我们利用该阳性细胞借助体细胞核移植的方法成功制备出一头健康的H11位点定点插入GFP基因的转基因猪，我们对其个体，及心、肝、脾、肺、肾与肌肉的组织切片进行荧光观察，结果显示GFP能高效表达，所以我们认为猪的H11位点允许外源基因的高效表达。 该项成果在猪中找到并鉴定出H11位点，针对猪的H11位点设计并制备了多种基因编辑工具，通过实验证明CRISPR/Cas9系统具有最高的效率，依托该CRISPR/Cas9在三种筛选方式下完成筛选，证明正筛选法具有最高的效率，并且利用无药物筛选法在猪中获得定点敲入细胞系，该项研究成功将大片段的DNA（9kb）插入该位点，最后该研究证明插入该位点的外源基因能在细胞，胚胎与个体水平均能高效表达。 综上所述，本研究依托基因组编辑技术针对猪H11位点创建了一个高效的定点整合系统，为今后转基因猪安全、高效的的制备奠定基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

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