基因组学分析粪肠球菌益生功能及增殖调控研究

发布时间：2018-11-01 18:55

【摘要】：益生菌能够维持和改善肠道微生物的平衡并且对宿主具有多种有益影响,为了能够发挥其功能,益生菌要能够耐受胃肠道的“恶劣环境”,并能够定植在肠道中。益生菌的益生性具有菌株特异性,然而目前国内益生菌制剂仅有菌种名称,没有菌株的具体功能特性信息和遗传背景信息,更没有菌株的全基因组信息。因此,本研究通过体外试验和比较基因组学分析相结合的方法,对粪肠球菌菌株的益生性和安全性进行评价,为益生菌制剂的开发奠定理论和应用基础。本文首先对分离自传统乳制品中能显著抑制致病菌的乳酸菌进行了筛选和鉴定,随后结合比较基因组学和药物敏感性实验对粪肠球菌的潜在益生性和安全性进行了关联分析,最后基于转录组学和代谢产物分析对粪肠球菌有氧呼吸条件下糖代谢途径的研究结果优化其增殖条件实现高密度培养。从传统发酵乳制品中分离得到116株乳酸菌,通过体外实验筛选得到4株产细菌素的乳酸菌菌株。随后对这4株菌的酸耐受能力、胆盐耐受能力和黏附能力进行研究,最终确定Enterococcus faecalis LD33可做为潜在的益生菌应用,并对其所产细菌素进行了初步纯化,利用Tricine-SDS-PAGE电泳确定其分子量约为10 KDa,且具有相对较好的热稳定性和酸碱稳定性。以E.faecalis LD33菌株为目的菌株,通过全基因组测序获得其基因组完成图。随后比较基因组学分析表明,其染色体上不但具有同酸耐受性和胆盐耐受性密切相关的ATPase、Na+/H+逆向转运蛋白、胆盐水解酶、环丙烷脂酰磷脂合成酶以及多个双组分调控系统的编码基因,而且还具有同黏附作用相关的黏附素蛋白、纤连蛋白、细胞表面蛋白、转肽酶和延长因子结合蛋白编码基因。此外,还具有一个由双组分调控系统、ABC型抗菌肽转运通透酶和细菌素编码基因构成的细菌素合成基因簇。这些功能基因恰好能够与体外实验结果E.faecalis LD33的良好酸耐受、胆盐耐受能力和黏附性以及对致病菌的抑制作用相互验证。比较基因组分析还发现E.faecalis LD33的染色体上无致病性毒力因子的编码基因且不具备通过基因岛、质粒等可移动基因元件来传播药物抗性的基本条件,抗生素敏感性测试实验表明其仅对氨基糖苷类抗生素及利福平具有抗性,可以作为益生菌来安全使用。通过转录组测序技术对发酵和有氧呼吸代谢条件下的E.faecalis LD33呼吸链和糖代谢相关基因的表达差异进行分析,发现E.faecalis LD33呼吸链编码基因属于组成型表达,与其是否进行有氧呼吸代谢无关,结合代谢产物分析结果发现当其进行有氧呼吸代谢时,其通过增加丙酮酸代谢通路和丁酸代谢通路中gap、pdh、eut D、ack A、als S和but A基因的表达量,降低ldh基因的表达量来改变葡萄糖的代谢途径,使碳水化合物代谢的主要终产物由乳酸变成乳酸、乙酸和乙偶姻,当葡萄糖被耗尽之后它能够通过代谢其他碳水化合物和氨基酸来继续增殖,从而获得更高的生物量和极强的长期存活率。基于以上转录组和代谢产物分析结果对E.faecalis LD33高密度培养条件进行优化,优化后E.faecalis LD33培养24 h后活菌数可以达到6.37×109 CFU/m L。长期保存实验表明,在4℃保藏5 d后在发酵条件下培养的E.faecalis LD33活菌数已经下降到106 CFU/m L,在第30 d已经很难检测到了,而在呼吸条件下经过45 d的保存,活菌数仍然维持在10~8 CFU/m L左右。
[Abstract]:Probiotics can maintain and improve the balance of intestinal microorganisms and have a variety of beneficial effects on the host, in order to be able to function, probiotic bacteria can withstand the 鈥渉arsh environment鈥，

本文编号：2304806