Fyn的RNA干扰和重要位点突变对神经元迁移的影响及分子机制

发布时间：2018-11-08 09:23

【摘要】：哺乳动物大脑皮层六层结构的形成依赖神经元的正确迁移,该过程受到多种信号分子的调节,神经元迁移障碍会造成多种神经系统疾病。Fyn是一种非受体酪氨酸激酶,Fyn敲除小鼠大脑皮质结构异常,大脑皮质浅层神经元数量减少,晚出生神经元异常定位在大脑皮质深层。Fyn在神经元迁移中发挥重要的调控作用,但其分子机制尚不清楚。为了研究Fyn对神经元迁移的影响及其分子机制,我们结合本实验室的前期研究结果,对Fyn在神经元迁移中的作用及其调控进行进一步探索。为了研究Fyn对神经元迁移的影响及其分子机制,利用子宫内电击转染技术,并结合RNA干扰和基因定点突变探讨了降低Fyn表达和N末端修饰位点突变对神经元迁移和神经元形态的影响。通过Western blot和免疫荧光染色检测Fyn下游可能的信号分子,构建这些分子的不同点突变载体,分别将其与Fyn超表达和干扰载体共同转染神经元,探索Fyn调节神经元迁移的信号通路。研究结果如下:1.在之前的研究中我们已经筛选出有效的干扰片段,结合子宫内电击转染发现降低Fyn表达不仅对晚出生的神经元迁移有影响,还抑制早出生神经元的迁移。在胚胎15.5天转染标记晚出生的神经元,出生后1天取材,对照组中大部分神经元已经到达它们的目的地——边缘带附近,干扰组中大部分被转染的神经元则滞留在中间带。并且,在出生后第7天,干扰组中许多神经元仍停留在中间带和皮质板,说明干扰Fyn抑制神经元迁移而不是延迟迁移。在胚胎12.5天转染标记早出生神经元,胚胎16.5天取材时对照组中神经元迁移进入皮质板,干扰组大部分神经元则滞留在中间带。降低Fyn表达在迁移初期阻碍神经元顶突起的形成,在中间带和皮质板交界处双极神经元比例降低,神经元多数呈圆形且没有形成明显的顶突起;进入皮质板的神经元顶突起增长,但存在一些极性反转的细胞;而接触到边缘带的细胞则顶突起长度增加且分枝减少。2.Fyn的N末端修饰包括第二位甘氨酸豆蔻酰化修饰、第三和第六位半胱氨酸棕榈酰化修饰以及第七和第九位甲基化修饰,N末端修饰对Fyn的功能具有重要调节作用。利用基因定点突变构建4种Fyn的N末端点突变真核表达载体:Fyn-G2A、Fyn-C3,6S、Fyn-K7A和Fyn-K7,9A。子宫内电击转染结果显示在胚胎15.5天转染后5天,Fyn-WT超表达抑制神经元迁移,神经元在脑室区和中间带形成团状聚集,几乎没有到达边缘带附近的神经元。各点突变载体转染组中,大多数神经元能够接触到边缘带,这与对照组相似但与Fyn-WT转染组相比有显著差异。Fyn-K7A,Fyn-K7,9A转染组中细胞聚集减少,在Fyn-G2A,Fyn-C3,6S转染组中没有神经元聚集现象。Fyn-G2A转染组中出现一些顶突起朝向脑室区的细胞,产生了类似干扰Fyn所引起的神经元极性反转。以上结果说明这些修饰位点在Fyn调节神经元迁移的过程中有重要作用。3.Western blot和免疫荧光染色发现Fyn引起FAK-Y925和PI3K-p85磷酸化,研究显示Rho蛋白GTP酶对神经元迁移有重要的调节作用。通过构建FAK-Y925F(不可被磷酸化),RhoA-DN,RhoA-CA,Rac1-DN,Rac1-CA,结合子宫内电击转染探索Fyn可能的信号通路。结果显示在胚胎15.5天转染后5天,FAK-Y925F+Fyn-WT转染组多数神经元到达边缘带附近,细胞聚集明显减少,说明FAK-Y925F能够挽救Fyn-WT造成的神经元迁移障碍和细胞异常聚集。Fyn-WT+Rac1-DN和shFyn+Rac1-CA转染组神经元在各层的分布与对照组和Fyn-WT组相比均有显著差异,神经元聚集减少,但仍有大量细胞形成团状或柱状聚集,说明Rac1参与Fyn对神经元迁移的调节,但只能在一定程度上挽救Fyn所引起神经元迁移障碍。Fyn-WT+RhoA-DN和shFyn+RhoA-CA转染组神经元在不同层的分布与对照组相似,Fyn-WT+RhoA-DN转染组形成聚集的神经元明显减少,shFyn+RhoA-CA转染组大部分神经元在中间带和皮质板交界处可以形成典型的双极形态,且皮质板中部分神经元顶突起恢复正常,但是到达边缘带的神经元仍然有较长的顶突起和较少的分枝,说明RhoA可能是Fyn调节神经元迁移的关键分子。综上所述,Fyn对早出生和晚出生的神经元迁移都有重要的调控作用,并对神经元形态造成影响,通过调节神经元形态变化影响神经元迁移。Fyn蛋白表达缺陷导致神经元顶突起形态异常,FAK和RhoA可能是Fyn调节神经元迁移的关键分子,Rac1也参与Fyn对神经元迁移的调控。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q42

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本文编号：2318059