植物乳杆菌素JLA-9的鉴定及其对芽孢杆菌抑菌机制的研究

发布时间：2018-12-17 16:25

【摘要】：乳酸菌细菌素是一类由乳酸细菌核糖体合成且具有抑菌活性的小分子多肽。目前研究发现乳酸菌可以产多种细菌素,乳酸菌细菌素由于其具有天然、安全、无毒等特点,目前已经被广泛应用于世界多个国家的食品防腐和保鲜领域。芽孢杆菌是乳制品、罐装食品、水果蔬菜等食品中常见的一类能够引起食品腐败和食源性疾病的细菌。因此,预防和控制食品中芽孢杆菌的污染是目前食品安全领域研究的一个热点。虽然现在已经有许多乳酸菌细菌素被报道,但是还没有广谱抑制芽孢杆菌的细菌素被研究。目前,人们已经逐渐意识到食品中的化学防腐剂对人体健康造成的潜在危害,因此开发天然、高效、安全的细菌素在食品保鲜领域具有广阔的应用潜力。本论文主要从来源于吉林省的农家酸菜中分离纯化产广谱抑制芽孢杆菌细菌素的乳酸菌,对所产细菌素进行分离纯化鉴定并对细菌素的生物学性质进行研究,探索细菌素对蜡样芽孢杆菌芽孢的抑制机理以及通过转录组学研究手段从分子水平上研究细菌素对蜡样芽孢杆菌的抑菌机理,为新型生物防腐剂的开发奠定理论基础。主要研究结果分述如下:1.从发酵酸菜中分离鉴定产广谱抑制芽孢杆菌细菌素的乳酸菌从吉林省发酵酸菜食品中分离纯化共获得产酸的革兰氏阳性菌株580株。以蜡样芽孢杆菌和短小芽孢杆菌作为指示菌经过初筛获得49株抑菌活性较好的菌株。以枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、生孢梭菌、产气荚膜梭菌和艰难梭菌作为指示菌进行复筛,获得5株抑菌活性较好的菌株。其中编号为JLA-9的菌株在5株菌中具有最好的抑菌活性。对其进行生理生化鉴定,并将其16SrDNA在NCBI网站中进行同源性比较,采用MEGA5.05软件绘制进化树。根据细菌系统发育分类学的分析结果,确定菌株JLA-9为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum ) 。2.细菌素plantaricinJLA-9的分离纯化、结构鉴定及性质研究LactobacillusplantarumJLA-9在48 h的发酵过程中不断产酸,到达稳定期后产酸基本保持不变。在对数前期开始产抑菌活性物质,稳定期后期产量达到最高。发酵30 h左右菌体进入衰亡期,抑菌活性物质产量保持不变。通过有机溶剂正丁醇萃取、Sephadex LH-20和Sephadex G-25凝胶层析及RP-HPLC纯化得到活性单峰,该活性峰对蜡样芽孢杆菌具有较好的抑菌作用。MALDI-TOF-MS及N-端测序确定抑菌活性物质的分子量为 1044 Da,其一级结构为 Phe-Trp-Gln-Lys-Met-Ser-Phe-Ala,经BLAST比对确定其为一种新型细菌素将其命名为plantaricin JLA-9。该细菌素对食品中常见的腐败性及致病性芽孢杆菌具有较广谱的抑制作用,并具有良好的热稳定性及pH稳定性,对常见的蛋白酶敏感。3. Lacotobacillus plantarum JLA-9 产细菌素 MRS 培养基的优化采用单因素试验筛选出植物乳杆菌JLA-9产细菌素MRS培养基的最佳碳源为果糖,添加量为30 g/L;最佳氮源为鱼粉蛋白胨、牛肉膏和酵母膏的配比,添加量为15:15:7.5 g/L;最佳磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾,添加量为3 g/L。通过响应面分析试验对植物乳杆菌JLA-9发酵产细菌素MRS培养基进行优化,确定最佳的培养基配方为果糖含量为35.03 g/L、鱼粉蛋白胨,牛肉膏和酵母膏的配比为14.5:14.5:7.3 g/L、磷酸二氢钾为2.95 g/L,抑菌相对效价较未优化前提高2.3倍。4.细菌素plantaricin JLA-9抑制蜡样芽孢杆菌芽孢机理研究采用2倍稀释法确定了细菌素plantaricin JLA-9对蜡样芽孢杆菌的MIC和OIC分别为16 μg/mL和32 μg/mL。通过研究蜡样芽孢杆菌芽孢萌发时折光率、热稳定性及2, 6-吡啶二羧酸(DPA)释放的变化,发现处理组与对照组芽孢的折光率和热稳定性都显著降低,芽孢中的DPA释放到外界环境中,表明plantaricin JLA-9不能够抑制芽孢萌发的开始。通过芽孢萌发试验证明萌发开始是plantaricin JLA-9作用于芽孢的必须条件,plantaricin JLA-9能够抑制萌发的芽孢生长成营养菌体细胞。采用MTT法研究了 plantaricin JLA-9抑制蜡样芽孢杆菌芽孢生长的氧化代谢活性,结果表明添加1 ×OIC 和 2×OIC ( 32 μg/mL 和 64 μg/mL )浓度的 plantaricin JLA-9 处理样品未检测到甲瓒的生成,因此证明plantaricin JLA-9能够抑制芽孢萌发生长过程的氧化代谢活性。应用流式细胞仪研究plantaricin JLA-9对蜡样芽孢杆菌芽孢萌发生长膜完整性的影响,结果表明添加 1×OIC 和 2×OIC ( 32 μg/mL 和 64 μg/mL )浓度 plantaricin JLA-9处理的样品,与对照相比其PI荧光强度明显增加,说明plantaricin JLA-9能够破坏芽孢膜的完整性。以DiOC2为荧光染料,利用多功能酶标仪测定plantaricin JLA-9处理后蜡样芽孢杆菌芽孢的荧光强度,研究plantaricin JLA-9对蜡样芽孢杆菌芽孢萌发生长细胞膜电位的影响。结果表明添加1×OIC和2×OIC ( 32μg/mL和64 μg/mL)浓度plantaricin JLA-9处理的样品膜电位显著降低,说明plantaricin JLA-9在芽孢萌发后导致细胞膜电位降低,最终抑制芽孢生长成营养菌体。5.基于转录组学的plantaricin JLA-9对蜡样芽孢杆菌的作用机制Plantaricin JLA-9对蜡样芽孢杆菌碳代谢及氮代谢产生了影响,经1/2×MIC (8μg/mL)浓度的plantaricin JLA-9处理后,蜡样芽孢杆菌糖酵解途径的fbp、fbaA和gapB基因,三羧酸途径中sucC、sdhC和mdh基因,脂肪酸-β-氧化途径的mmgC和aatoB基因,氨基酸α-酮戊二酸代谢途径中的proC、rocF和glsA基因,均明显上调。说明经过细菌素plantaricin JLA-9处理后,蜡样芽孢杆菌的葡萄糖无氧分解代谢减少,三羧酸循环代谢增强,脂肪酸氧化产生的乙酰-CoA可以经过三羧酸循环途径为生物体产生能量,氨基酸代谢与三羧酸循环被联系起来促进能量的代谢合成。经细菌素plantaricin JLA-9处理后,蜡样芽孢杆菌芽孢形成相关的重要调控基因sigE、sigF、sigK和sigG的表达下调,以及芽孢形成不同阶段的芽孢形成基因racA和cotE等也明显的下调,因此细菌素plantaricin JLA-9能够抑制蜡样芽孢杆菌芽孢的形成。细胞膜相关基因fabG和fabZ上调,说明蜡样芽孢杆增加支链脂肪酸的合成从而提高细胞膜的流动性,促进生物膜修复。细菌素plantaricin JLA-9对蜡样芽孢杆菌离子转运产生影响。研究发现经细菌素处理后,kcH基因与nhaC基因上调。kcH基因与钾离子的摄入有关,细胞通过上调该基因来摄入更多的钾离子,以维持细胞的渗透压来保持细胞膜的稳定状态。nhaC基因发生上调,该基因参与芽孢杆菌pH内平衡的调节,它的上调说明,由于细胞膜被破坏,钾离子流失,为了维持细胞的渗透压需要从细胞内排出更多的钠离子。经细菌素plantaricinJLA-9处理后,蜡样芽孢杆菌次黄嘌呤核苷酸(IMP)合成途径的purL、purQ及purC基因下调。说明次黄嘌呤的合成受到了抑制,而次黄嘌呤是其他嘌呤核苷酸的前体,说明细菌素处理抑制了核苷酸的初始合成途径。此外,腺嘌呤和尿嘧啶降解途径的基因被增强,表明细菌素处理也促进了核酸前体物质的降解。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3

【参考文献】