【摘要】：小型啮齿类动物小鼠(musculus),在地球上分布广泛,种类繁多,并广泛应用于生物相关领域的研究。从第一个近交系小鼠品系(DBA)培育至今,并伴随着各类小鼠资源的不断发展和积累,小鼠已成为最重要的模式动物,小鼠遗传学也俨然成为一个重要的研究领域。随着小鼠遗传学的不断发展,小鼠遗传学研究也从单基因研究步入多基因调控的复杂性状研究。迄今,虽然已在小鼠基因组中定位大量调控复杂性状的数量性状基因座(quantitative trait loci,QTL),但其中仅有小部分基因被成功定位克隆。研究表明,小鼠QTL精细定位和复杂性状相关功能基因定位克隆之所以进展缓慢的主要原因:1)传统QTL定位方法耗时、耗力,分辨率低:QTL初步定位区段大(20~40c M),通过构建同类系及反复杂交积累重组事件(几年时间)实现QTL的精细定位(1~2c M);2)QTL精细定位困难:现有实验小鼠起源单一,等位基因数量少;遗传多样性匮乏,连锁不平衡程度高;只有100多年的历史,累积重组事件少。综合上述原因导致小鼠QTL精细定位及复杂性状相关基因定位克隆极其困难。为克服上述问题,为小鼠遗传学研究奠定基础,本论文首次以中国地区野生小家鼠为研究对象,主要开展以下三个方面的工作:部分一:构建野生小家鼠来源1号染色体替换群体。中国具有丰富的野生小家鼠资源,包括北方M.m.musculus和南方M.m.castaneus两个亚种,且在长江流域具有较宽泛的亚种杂交地带。具有丰富遗传多样性的野生小家鼠是复杂性状研究的理想资源,但中国野生小家鼠的研究和利用相对滞后。而染色体替换系品系是基因挖掘、遗传学和表观遗传性学及功能研究的重要策略之一。迄今小家鼠1号染色体上已初步定位超过1000个QTLs,仅有小部分基因被鉴定出来。为促进小鼠1号染色体上已知QTL的精细定位,并进一步定位克隆功能基因,为现有实验室小鼠品系小鼠遗传学研究增添新成员。本论文1)基于前期构建的三组PCR-LDR分型系统,快速筛选携带未重组1号染色体的小鼠个体用于回交,加速野生小家鼠来源1号染色体替换群体(population of chromosome one substitution strains,PCSSs)的构建进程;2)构建基于竞争性聚合酶链式反应(competitive polymerase chain reaction,c PCR)技术的拷贝数变异(copy number variation,CNV)检测方案,并结合三组PCR-LDR分型方案协同监控野生小家鼠来源1号染色体的稳定遗传;3)采用两步法自交方案,克服了小鼠大规模饲养和大量基因分型工作等多方面难点,实现PCSS各品系1号染色体的快速纯化;4)采用全基因组芯片扫描技术,实时监控回交过程中各品系基因组背景纯度,且染色体工程小鼠随着回交代数的不断增加小鼠基因组背景纯度将逐渐提高。结合三组PCR-LDR分型方案、2步法自交方案和全基因组芯片扫描,最终成功建立25个1号染色体替换系品系。野生小家鼠来源PCSS群体填补了国内外就中国野生小家鼠遗传资源利用的空白,为现有实验室小鼠品系添加新的成员。部分二:20个1号染色体替换系品系的遗传质量评估。2002年,近交系C57BL/6J(简称B6)的全基因组DNA序列信息的获取,大力推动了小鼠正向遗传学的发展。且随着测序技术的不断发展,小鼠基因组计划利用高通量二代测序技术已完成36个近交系的基因组测序,通过深入解析品系间SNPs,In Dels,结构变异(structure variations,SVs)等遗传多样性,并建立相应的数据库,进一步推动了小鼠遗传学的快速发展,及小鼠进化史和环境适应性等方面的研究。在成功构建中国野生小家鼠来源1号染色体替换系群体的基础上,本论文1)采用Illumina Hiseq2500和Illumina Hiseq X Ten测序平台,分别针对昆明白鼠来源和19个野生小家鼠来源1号染色体替换系品系完成全基因组重测序,平均测序深度均㧐30×。通过数据质控,过滤低质量数据和接头后,获得了充足有效、高质量测序数据用于后续生物统计学分析;2)采用speedseq软件深入挖掘了20个品系的遗传多样型,共累积发现4.1×107个遗传变异。其中B6-Chr1KM品系中的数量最少,只有7.61×105,而19个品系的野生小家鼠来源1号染色体上则含有大量遗传多样性,远超实验小鼠。野生小家鼠来源1号染色体上平均含有的SNP数量为1.38×106(SNP密度为7.06个SNP/Kb),高于实验小鼠群体(1.25个SNP/Kb)。并采用Variant Effect Predictor软件完成各种遗传变异的功能注释,共发现2684个基因有可能受到影响。3)根据20个品系的SNP数据:发现16个品系的1号染色体纯合度均㧐98%,而B6-Chr1HZ、B6-Chr1TZ、B6-Chr1TZ和B6-Chr1TZ 4个品系的纯合度分别为97.19%,91.90%,80.00%和75.96%,因此20个野生小家鼠来源1号染色体替换系品系适用于后续遗传学研究的。4)在20个品系的基因组背景中,均残留供体品系的遗传信息(称“Island”),其中B6-Chr1YX品系的基因组背景杂合度最低为0.27%,B6-Chr1ZZ2品系最高为6.46%。5)通过研究20个品系1号染色体的遗传结构说明,小家鼠作为人类伴生种在中国地区主要分布两个亚种M.m.castaneus和M.m.musculus,且随着人类活动的增加和频繁流动,南北小家鼠彼此频繁迁移和基因的相互渗透,形成一较大的杂交地带。野生小家鼠来源1号染色体替换系群体的全基因组DNA序列信息的获取及初步解析,填补了国内外就中国地区野生小家鼠DNA序列信息的空白,是国内外小鼠遗传学研究的有益补充,为复杂性状相关QTLs的精细定位和相关功能基因的定位克隆奠定了坚实基础。部分三:PCSSs群体的表型鉴定及分析。模式动物小鼠是人类相关疾病研究的重要模型,并广泛应用于生理学和病理学研究中。小鼠遗传学的最终目的是揭示与表型相关的功能基因,因此表型检测始终是小鼠研究过程中至关重要的组成部分。后基因组时代,单一和简单的表型检测难以适用于复杂性状相关的研究需要,因此针对复杂性状开展广泛的表型检测工作受到了广泛关注。本论文以B6-Chr1SJ,B6-Chr1ZZ2,B6-Chr1ZC,B6-Chr1TW,B6-Chr1SMX,B6-Chr1ZZ1,B6-Chr1CM,B6-Chr1HZ和B6-Chr1KM共9个1号染色体替换系品系为研究对象,采集了小鼠生长发育和生理生化等表型数据,并建立了表型数据库。通过统计学分析鉴别出与B6品系具有显著星差异的染色体替换系品系及表型:如B6-Chr1KM(P=0.000)、B6-Chr1ZZ1(P=0.014)和B6-Chr1TW(P=0.031)的1日龄雌鼠体重与B6雌鼠具有显著性差异,而其它品系与B6无显著差异;B6-Chr1ZZ1、B6-Chr1TW、B6-Chr1SJ、B6-Chr1SMX和B6-Chr1ZZ2 5个野生小家鼠来源的替换品系的阴门开启时间显著高于B6,且具有显著性差异(P㩳0.05);B6-Chr1CM、B6-Chr1SJ、B6-Chr1SMX和B6-Chr1ZZ24个品系的包皮脱落时间高于B6(P㩳0.05);B6-Chr1HZ雌鼠的ALP显著高于B6(P=0.001),而B6-Chr1KM雄鼠则显著低于B6(P=0.031);B6-Chr1CM雌鼠的ALT显著高于B6(P=0.011);B6-Chr1CM(P=0.000)、B6-Chr1SMX(P=0.000)、B6-Chr1HZ(P=0.041)雄鼠的TB显著高于B6;B6-Chr1SMX雄鼠的TG显著高于B6(P=0.044);B6-Chr1TW雄鼠的TC显著高于B6具有显著差异(P=0.005)等。通过归纳整理表型数据并录入表型数据库,为研究染色体替换系群体的表型,深度挖掘QTL打下了良好的基础。本论文针对当前小鼠资源在复杂性状遗传学研究领域中面临的困难,在国内外首次利用具有丰富遗传多样性和积累丰富重组事件的中国野生小家鼠,成功构建野生小家鼠来源1号染色体替换系群体,深入探索20个品系野生小家鼠来源1号染色体的遗传多样性和遗传结构和基因组背景信息,进一步采集了9个1号染色体替换系品系的基础表型和血液生化等表型数据,并建立了野生来源小家鼠1号染色体替换系群体基础数据库。本论文研究结果显示,20个野生小家鼠来源1号染色体替换系品系的1号染色体具有丰富的遗传多样性,且大量基础表型和血液生化等表型与近交系品系B6具有显著性差异。因此,PCSSs群体是复杂性状研究的优势资源,PCSSs群体为小鼠遗传学研究提供优质遗传资源,也为后续QTL精细定位和相关基因定位克隆奠定坚实的基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78
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本文编号：
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