斯达油脂酵母累积油脂的分子基础研究

发布时间：2019-02-16 07:20

【摘要】：斯达油脂酵母(Lipomyces starkeyi)能利用多样的碳源发酵产生油脂,其油含量达到细胞干重的60%以上,油脂的脂肪酸组成与植物油类似,有望替代植物油作为生物柴油产业的新原料。近年来利用斯达油脂酵母发酵生产生物柴油受到了广泛的关注,但是目前利用斯达油脂酵母发酵存在油脂产率和培养条件不稳定的问题。本研究调查了斯达油脂酵母对不同碳源(包括葡萄糖、木糖、甘油和柳木木屑水解液)的发酵以及在葡萄糖培养时生长和油脂的累积规律；通过基因表达模式分析、异源表达和同源重组敲除等方法鉴定斯达油脂酵母中油脂累积关键基因的功能,并探究了酵母中油脂累积的机制；展开了斯达油脂酵母在葡萄糖和木糖作为单一碳源培养时的转录组学研究,对木糖代谢相关的关键基因进行鉴别。通过以上研究以期望为斯达油脂酵母的菌株改良与工业上生产放大的条件优化提供理论指导。论文主要研究结果如下：1.斯达油脂酵母能利用多种碳源包括葡萄糖、木糖、甘油和柳木木屑水解液进行发酵。当以葡萄糖为单一碳源时,C/N越高越能促进斯达油脂酵母的油质和饱和脂肪酸(C16：0和C18：0)的累积。斯达油脂酵母分别使用葡萄糖、木糖、甘油和柳木木屑水解液发酵时,油含量和油产量分别为47.0%、5.8g/L,36.6%、3.8g/L,46.2%、4.2g/L和42.7%、3.5g/L。由此可知,斯达油脂酵母能利用木糖、甘油和柳木木屑水解液作为底物进行油脂生产,但葡萄糖是斯达油脂酵母油脂生产的适用底物。2.通过调查对斯达油脂酵母在葡萄糖作为单一碳源时的油脂和干重累积规律发现,酵母生长经历适应期、对数期和稳定期,与其对应的培养时间点分别为12-h、48-h和96-h,细胞干重和油含量分别为0.55g/L、17.3%,7.21g/L、33.8%和12.97g/L、45.3%。为了鉴别斯达油脂酵母控制油含量的关键功能基因,我们根据油脂累积规律使用Real-time PCR技术对包括L. starkeyi acetyl-CoA carboxylase (LsACC1)基因在内的18个油脂代谢相关基因的表达模式进行检测,发现LsACCl、四个酰基辅酶A：二脂酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)与油脂的合成密切相关,这为酵母油脂累积的机制研究提供了分子基础。3.我们创造性地建立了一种载体构建方法Improved restriction digestion-ligation (IRDL),筛选LsACC1进行功能鉴定和分析,构建了在非油脂酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达载体。对酿酒酵母的油脂累积机制调查发现,通过在甘油合成缺陷突变体YA103(甘油-3-磷酸酶GPP1和GPP2都被敲除)中进行自身甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD1)基因过表达和饲喂油酸发现,脂肪酸是其油脂累积的主要限制因素,而乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因是脂肪酸合成的关键基因。然后,在酿酒酵母YA103中表达LsACC1能显著提高油含量,这说明LsACC1具有ACC酶的功能。为了进一步说明油脂累积的机制,我们构建了斯达油脂酵母的转化体系,然后进行LsACC1基因的单等位基因的敲除,结果基因表达量显著下降,油脂含量仅为野生型的一半左右。这说该基因是油脂酵母油脂累积的关键基因。由于L. starkeyi glycerol-3-phosphate dehydrogenase (LsGPD1)在斯达油脂酵母整个油脂累积过程表达量变化不显著,而该基因又与油脂合成的底物甘油-3-磷酸合成密切相关,说明甘油-3-磷酸在油脂合成过程中是充足的。这些表明无论在油脂酵母还是非油脂酵母中,脂肪酸都是油脂累积的主要限制因素。为了进一步挖掘斯达油脂酵母油脂合成的其它关键基因,我们克隆了四个DGAT(LsDGAT11、LsDGAT12、LsDGAT13和LsDGAT2)和一个LsGPD1基因。基因结果分析显示这四个DGAT基因分为两种截然不同的功能结构域。利用酵母中性脂合成缺陷型菌株H1246分别异源表达这四个DGAT,发现LsDGAT11和LsDGAT2可恢复酵母三脂酰甘油(TAG)的合成,LsDGAT12可恢复酵母固醇酯(SE)的合成,LsDGAT13和非中性脂类的合成相关。LsDGAT11和LsDGAT2对TAG累积量的贡献显著大于酿酒酵母自身的DGA1。在YA103中表达LsGPD1,发现其甘油-3-磷酸含量为酿酒酵母GPD1过表达含量的3.8倍。说明油脂酵母的DGAT和GPD基因比非油脂酵母的功能更强。4.为了降低微生物的发酵成本,我们通过RNA-Seq测序技术解析斯达油脂酵母利用木糖的代谢机制,对斯达油脂酵母在葡萄糖或木糖作为单一碳源培养时进行转录组深度测序,获得8191个基因,其中488个基因有表达差异。进一步生物信息学分析发现24个基因与木糖运输相关,10个基因与木糖的代谢途径相关,并且大部分基因在木糖培养时表达水平显著上调。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936

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本文编号：2424196