【摘要】：本学位论文系统的研究了镉(Cadmium, Cd)对背角无齿蚌(Anodonta woodiana)的急性毒性效应；Cd在蚌体组织中的蓄积及诱导金属硫蛋白(Metallothionein, MT)的表达；以及鳃和外套膜细胞凋亡的情况,从组织损伤和细胞凋亡的角度探讨了Cd对背角无齿蚌的毒性作用机制。采用急性毒性实验,首先观察了Cd胁迫背角无齿蚌的毒性效应,通过概率单位法计算得到Cd致背角无齿蚌的半致死剂量,并得到Cd胁迫背角无齿蚌的安全浓度。之后在Cd急性毒性实验(Cd浓度为0、4.21、8.43、16.86、33.72和67.45 mg/L时间为24、48、72和96h)下,采用火焰原子吸收法和镉-血红蛋白饱和技术,研究了Cd在五种主要组织(鳃、外套膜、足、内脏团、消化腺)中的蓄积作用,以及对组织中MT表达量的影响,同时分析了Cd在组织中的蓄积与组织表达MT的相关性。在此基础上,选择Cd蓄积量显著,且MT表达量与Cd蓄积量具有正相关性的鳃和外套膜组织,在Cd急性胁迫背角无齿蚌(Cd浓度为0、8.43、16.86、33.72和67.45mg/L,处理时间为96h)下,运用酶学方法,检测了鳃和外套膜中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活性和H2O2含量。同时,利用DNA Ladder电泳技术检测了鳃和外套膜中DNA Ladder图谱变化情况。最后,运用电子显微镜观察了Cd胁迫组(Cd浓度为0、16.86和67.45 mg/L)中鳃和外套膜亚显微结构的病理变化和损伤情况。得出研究结果如下：1.镉急性胁迫背角无齿蚌产生的毒理效应随着Cd处理时间的增加,背角无齿蚌均出现了不同程度的中毒症状。实验初期,背角无齿蚌双壳紧闭,进水管和出水管很少伸出,基本停止过滤觅食。随后,背角无齿蚌双壳陆续张开,足向外伸展,外界刺激后足收缩迟钝,双壳闭壳缓慢或不能完全闭合,直至死亡,水体中出现大量的白色絮状浑浊物质。在24、48、72和96h,Cd致背角无齿蚌的半致死剂量分别为562.3、331.1、182.0和134.9 mg/L。计算得到Cd对背角无齿蚌的安全浓度为1.35 mg/L。2.镉在背角无齿蚌组织中的蓄积及对金属硫蛋白含量的影响在对照组中,Cd在背角无齿蚌组织中的蓄积高低顺序为鳃外套膜足内脏团消化腺；Cd处理组中,随着处理时间的增加,五种组织中Cd蓄积量均出现不同程度的升高,较对照组差异显著(P0.05)；Cd的最大蓄积量出现在消化腺中,当Cd处理浓度为67.45 mg/L,时间为48 h,消化腺中Cd蓄积量达到最大值(P0.05)。随着Cd处理浓度和处理时间的增加,MT在鳃和外套膜中的表达量显著升高(P0.05),鳃和外套膜中MT含量与Cd蓄积量表现出正相关性(P0.05)。3.镉致背角无齿蚌鳃组织亚显微结构改变及对细胞凋亡的影响随着Cd浓度的增加,鳃中Caspase-3和Caspase-9活性总体呈现出逐渐增高的趋势,高浓度Cd处理下活性显著升高(P0.05)；Caspase-8活性表现为低浓度Cd处理下活性显著降低(P0.05),中浓度和高浓度Cd处理下活性显著增高(P0.05)；鳃中H2O2含量表现出先升高后逐渐回落的趋势。随着Cd处理浓度的逐渐增加,DNA Ladder图谱逐渐清晰,出现细胞凋亡典型的DNA Ladder条带。Cd浓度16.86mg/L处理96h,鳃组织细胞形态和结构变化明显。上皮细胞表面微绒毛数量减少,部分脱落；部分细胞核核膜肿胀并内陷,染色质致密浓缩、边集；线粒体数量减少,形态肿胀、嵴数量减少并空泡化；粗面内质网破裂后形成大小不等的泡状结构；高尔基体形态萎缩。Cd浓度67.45 mg/L处理96h,鳃组织细胞损伤非常严重,形态结构呈畸形,大部分细胞器消失。上皮细胞表面的大部分微绒毛脱落并消失；细胞核水肿严重,染色质浓缩并出芽裂解成核碎片；线粒体肿胀呈囊泡状,嵴基本消失；粗面内质网解体；高尔基体囊泡层结构消失。4.镉致背角无齿蚌外套膜组织亚显微结构改变及对细胞凋亡的影响与对照组对比,随着Cd浓度的增加,外套膜中Caspase-3活性表现为先降低后显著升高的趋势(P0.05)；Caspase-8活性呈现逐渐升高,差异显著(P0.05)；Caspase-9活性在低浓度和高浓度组显著降低,但中高浓度组显著升高(P0.05)；外套膜中H202含量呈现逐渐增高的趋势,差异显著(P0.05)。Cd处理组中,DNALadder图谱逐渐清晰,出现细胞凋亡典型的DNA Ladder条带。Cd浓度16.86 mg/L处理96h,外套膜组织细胞结构的变化明显。微绒毛排列杂乱、大部分断裂并且空泡化严重；细胞核染色质不规则凝聚、固缩和边集,核膜破裂；线粒体肿胀、嵴数量减少、空泡化比较严重。Cd浓度67.45 mg/L处理96 h,外套膜组织细胞损伤更加明显。染色质大部分凝聚、固缩和边集,核膜严重肿胀并破裂；粗面内质网板层状结构解体后形成许多大小不等的小泡。研究结果表明：1.镉对背角无齿蚌的急性毒性效应明显,背角无齿蚌表现出典型的中毒症状。消化腺作为消化和解毒器官,对Cd的蓄积能力最强；鳃和外套膜作为呼吸和滤食器官,对Cd也有很强的蓄积能力；足和内脏团对Cd的蓄积力要弱于消化腺、鳃和外套膜。五种组织对Cd的富集作用及表达MT的能力具有明显的组织差异性,其中,鳃和外套膜对Cd的蓄积量和MT的表达量呈现正相关性,组织中MT的含量可以作为Cd污染的生物标志物。应用MT为生物标志物,可以考虑将鳃和外套膜组织作为靶器官应用到水环境Cd污染监测中。2.镉急性胁迫背角无齿蚌,外套膜组织受到氧化胁迫,产生了大量的H2O2,并且呈现剂量效应关系；组织中Caspase-3和Caspase-9活性表现为相似的激活效应。外套膜组织细胞凋亡可能是通过线粒体引发途径实现的,Cd可以通过诱导H2O2引起caspase级联反应后触发细胞凋亡。3.镉急性胁迫背角无齿蚌,鳃组织中H2O2没有表现出典型的剂量效应关系；组织中Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性表现出相似的激活趋势。鳃组织细胞凋亡可能是通过细胞表面死亡受体途径和线粒体引发途径两种途径共同执行的。鳃和外套膜均表现出了细胞亚显微结构和DNA Ladder图谱的细胞凋亡特征。
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【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X171.5
【参考文献】
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2447276
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