Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性研究及其在高山被孢霉中的应用

发布时间：2019-04-01 13:08

【摘要】：生物体中的多不饱和脂肪酸是通过脂肪酸合成途径逐步生成的,而Δ6脂肪酸脱饱和酶(delta 6 fatty acid desaturase,FADS6)是这个途径中催化亚油酸(linoleic acid,LA)和α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA)在6位碳脱饱和分别形成γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和十八碳四烯酸(stearidonic acid,SDA)的关键酶,该酶的底物选择性直接决定生物体内ω6和ω3脂肪酸的分布。在ω6和ω3组成比例存在显著差异的生物体中,其Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物选择性不同。高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)已被广泛应用于花生四稀酸(arachidonic acid,AA)的生产,其ω6系脂肪酸含量达到总脂含量的40%,而ω3系脂肪酸如二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)含量很低(仅低温能产,含量为1-3%);而细小微胞藻中EPA含量达到总脂含量的26%,ω6系脂肪酸含量却很低(仅0.1%左右)。本研究从分析高山被孢霉和细小微胞藻的Δ6脂肪酸脱饱和酶基因入手,从蛋白质一级结构层面解析影响FADS6底物选择性的关键区域和位点,并将偏好ω3系的细小微胞藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因应用于高山被孢霉生物合成EPA的研究。主要研究结果如下:1.Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物选择性研究:以pYES2/NT C质粒为骨架构建了细小微胞藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因和高山被孢霉Δ6-I与Δ6-II脂肪酸脱饱和酶基因的表达载体并转化至酿酒酵母,通过在培养基中添加Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物来考察3个Δ6脂肪酸脱饱和酶对各底物的选择性。结果表明,高山被孢霉中Δ6-I脂肪酸脱饱和酶(MaFADS6-I)对ω6系的LA具有底物选择性,Δ6-II脂肪酸脱饱和酶(MaFADS6-II)对底物没有选择性,而细小微胞藻中Δ6脂肪酸脱饱和酶(MpFADS6)对ω3系的ALA具有底物选择性。2.分析影响Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性的结构区域:为研究MaFADS6-I和MpFADS6具有不同底物偏好作用的机制,将两者的氨基酸序列按照保守区域划分为五部分,利用重叠延伸PCR的方法获得了十种重组Δ6脂肪酸脱饱和酶的融合基因,并在酿酒酵母中测定了这十种Δ6脂肪酸脱饱和酶融合酶的活性。结果表明,Δ6脂肪酸脱饱和酶中His I区和His II区之间的片段对其底物选择性有重要影响;细胞色素b5区(HPGG)和His I区之间的片段也对其底物选择性有影响;底物浓度的改变不会影响Δ6脂肪酸脱饱和酶的底物选择性。3.分析影响Δ6脂肪酸脱饱和酶活性的关键催化位点:在定位了影响Δ6脂肪酸脱饱和酶底物选择性关键区域的基础上,选取细小微胞藻Δ6脂肪酸脱饱和酶His I区和His II区域内37个氨基酸残基中的7组位点进行定点突变,研究结果证明MpFADS6中G194,E222,M227和V399/I400四组位点对底物的识别起重要作用;进一步选取高山被孢霉Δ6-I脂肪酸脱饱和酶中细胞色素b5区(HPGG)下游的5组位点进行定点突变,研究结果证明MaFADS6-I中K61和D68两组位点对LA的催化作用有重要影响。从而找到Δ6脂肪酸脱饱和酶两个关键区域中影响其催化活性的关键位点。4.偏好催化ω3系ALA的MpFADS6基因在高山被孢霉中的异源表达:首先以pBIG2-ura5s质粒为骨架构建了MpFADS6的二元表达载体,然后利用根癌农杆菌介导方法将MpFADS6基因整合至尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉的基因组,通过对转化子的筛选和鉴定得到了高山被孢霉重组菌株(Ma-MpFADS6)。5.高山被孢霉重组菌株应用于EPA合成:在恒温和变温培养条件下,高山被孢霉重组菌中EPA产量分别为80.0 mg/L和90.4 mg/L;为了提高MpFADS6底物的含量,以游离型ALA为外源底物,高山被孢霉重组菌中EPA产量达到114.5 mg/L;考虑培养成本和游离型底物稳定性的因素,以富含ALA的牡丹籽油(PSO)和牡丹籽粕(PSM)为外源底物,高山被孢霉重组菌中EPA产量分别达到149.3 mg/L和515.29 mg/L;在外源添加50 g/L PSM于5升发酵罐发酵16天后,高山被孢霉重组菌株中EPA产量达到588.5 mg/L,占总脂的7.8%,比原始菌株(0.8%)提高了9.8倍,利用分批补料发酵方法发酵16天后,高山被孢霉重组菌株中EPA产量提升至638.5 mg/L,比原始菌株(22.5mg/L)提高了28.4倍,成功实现了在高山被孢霉中通过ω3脂肪酸合成途径生产EPA。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q55;TQ925

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本文编号：2451577