乳酸克鲁维酵母表达异源木聚糖酶B工程菌改造及蛋白分泌机制研究

发布时间：2019-09-28 00:52

【摘要】：乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)作为一种优秀的外源蛋白表达宿主菌,它在食品工业和制药工业里蛋白产物的大规模生产中有着重要的应用。实验室前期研究中,构建了海栖热袍菌耐热木聚糖酶工程菌K. lactis GKX31。当目的蛋白表达量提高时,细胞壁合成相关基因KIGAS1-1、分子伴侣蛋白基因KIER01和KIKAR2以及UPR反应相关基因KIGCN4的转录水平发生显著变化。在本研究中分别采用基因敲除和基因过表达的策略探讨宿主菌改变对异源蛋白合成、修饰及分泌过程产生的影响。通过氨基酸序列分析和三维结构预测表明,乳酸克鲁维酵母中的KIGAS1-1基因和KIGAS1-2基因产物与酿酒酵母中细胞壁合成相关的β-1,3-葡聚糖基转移酶基因GAS1的基因产物的相似性分别为67%和64%,它们都具有一个葡聚糖基转移酶结构域Glyco_hydro_72以及一个与糖类结合功能相关的X8结构域。预测两基因编码的产物具有β-1,3-葡聚糖基转移酶功能,并在乳酸克鲁维酵母细胞壁合成中发挥作用。利用同源双交换的方法,成功构建了KIGAS1-1敲除突变株K. lactis Kl-1、KlGAS1-2敲除突变株K. lactis K1-2以及双敲除突变株K. lactis KD。KIGAS1-1、KIGAS1-2两基因的敲除不会影响细胞的生长和细胞形态,而双敲除会使菌株生长滞后并且细胞变为球形出现异常膨大现象。通过透射电子显微镜观察发现,敲除KIGAS1-1会使细胞壁厚度减小,而敲除KIGAS1-2产生了相反的表型变化使细胞壁厚度增大。荧光定量PCR技术分析,发现KIGAS1-1、KIGAS1-2和KIGAS3是乳酸克鲁维酵母在营养生长过程中主要表达的KIGAS家族基因。KIGAS1-1、KIGAS1-2以及其他KIGAS家族基因在转录水平上存在互补作用。KIGAS家族基因的整体表达水平决定了各菌株细胞在形态、生长和细胞壁厚度上的差异。KIGAS1-1和KIGAS1-2基因的敲除能够影响乳酸克鲁维酵母外源蛋白分泌。KIGAS1-1基因单敲除和两基因双敲除能够提高外源蛋白分泌量(分别提高17.7%和11.5%),而KIGAS1-2基因单敲除则会降低外源蛋白分泌量(降低35.6%)。KIGAS1-1和KIGAS1-2基因的敲除能够改变菌株中多个与蛋白分泌和运输过程相关基因的转录水平。各菌株中外源蛋白分泌效率的差异与菌株内蛋白分泌和运输过程相关基因的转录水平变化之间存在相关性。推测转录水平提高的蛋白分泌和运输过程相关基因能够促进外源蛋白的分泌。综合考虑,K1-1是一种较好的外源蛋白“超分泌”型菌株,敲除KIGAS1-1基因是一种更有效的通过改造细胞壁提高外源蛋白分泌水平的方案。使用‘'DNA Multimer直接转化法”构建了过表达载体pRS426-Gk,进而分别构建了KlERO1, KIKAR2和KIGCN4过表达菌株K. lactis GKERO、K. lactis GKKAR和K. lactis GKGCN。通过比较细胞生长和耐热木聚糖酶B产量等方面的差异,发现KIERO1、KlKAR2及KIGCN4的过表达都会使菌株细胞的生长滞后,KIERO1和K1KAR2的过表达能够促进外源蛋白的分泌(分别提高33.6%和14.1%),而KIGCN4的过表达则不能促进外源蛋白的分泌。发现在外源蛋白分泌水平相对较低的菌株中KICOG6、KlIMH1、KICUP5的表达量相对较高。推测分泌蛋白向液泡的运输及降解是制约外源蛋白产量提高的瓶颈因素,为进一步对乳酸克鲁维酵母工程菌进行改造提高外源蛋白分泌提供了实验依据。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93
，

本文编号：2542997