十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究

发布时间：2017-03-19 11:08

  本文关键词：十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：甲壳经济动物的繁殖是我国水产界研究的热门话题。而精子发生机制是繁殖生物学领域关注的重大科学问题之一。精子发生机制的研究是人工进行水产经济物种繁殖的基础。精子发生过程中的细胞骨架的重构、分子调控机制是目前该领域的研究热点。与哺乳动物精子发生存在巨大差异的地方是,甲壳动物精子没有鞭毛结构。其精子发生过程主要包含顶体形成和细胞核形变事件。我们对甲壳纲十足目动物精子发生过程中细胞骨架结构、动力学机制以及生理学方面进行了研究。第一部分十足目游泳亚目真虾属秀丽白虾精子发生细胞骨架及其动力学机制研究顶体架构体(AFS)是真虾类精子形成中出现的细胞骨架结构,首次发现是在日本沼虾精子发生过程中,但其组成以及功能目前尚未有报道。我们以太湖主要的经济虾类秀丽白虾作为研究模型,研究AFS是否是真虾类精子形成中普遍存在的骨架结构。通过免疫荧光实验对Tubulin在精子形成不同时期的定位实验,证明秀丽白虾精细胞中也存在AFS结构,其主要组分为微管,根据其形态预测还有少量微丝以维持细胞柔韧性。这一结果说明AFS是真虾类精子发生共同存在的细胞骨架结构。为研究与该细胞骨架结构共同发挥功能的马达蛋白,我们克隆了驱动蛋白kifc1基因,并对其结构、基因及蛋白的分布、运载的货物进行了研究。通过免疫荧光实验对细胞器高尔基体标记物GM130以及线粒体标记物与KIFC1的共定位,我们发现驱动蛋白KIFC1与上述细胞物质在顶体形成部位以及细胞核一侧边缘具有高度共定位,暗示这些细胞成分是KIFC1运输的货物。综上所述,驱动蛋白KIFC1依赖AFS细胞骨架结构运输细胞器以形成真虾类精子发生中出现的临时细胞器片层复合体(LCx),最终帮助成熟精子中外翻的伞状顶体的形成和盘状细胞核的变形。第二部分十足目爬行亚目中华绒螯蟹精子发生过程中p53参与的生精细胞凋亡研究为了研究十足目甲壳动物正常生精过程中的的保护机制,我们从中华绒螯蟹精巢组织中克隆了p53同源基因。对其序列分析结果显示,该p53同源基因具有保守的DNA结合区域和锌结合位点。p53基因在不同组织中的半定量分析结果暗示p53基因的普遍存在性以及其对生命活动的必要性。通过原位杂交实验检测了p53基因在精子形成各时期的表达特征。其基因分布暗示p53可能会对损伤的DNA进行修复以保证正常的精子发生,或引发凋亡以去除不正常的精细胞。但p53是如何发挥这些功能的,在未来的工作中我们还需要深入研究。第三部分十足目爬行亚目中华绒螯蟹精子发生过程中PHB介导的线粒体泛素化研究中华绒螯蟹的精子含有杯状核,核杯开口处有数个线粒体深陷核内,顶体囊片层结构中镶嵌有线粒体衍生物。该线粒体分布模式的形成过程包含线粒体数量消减、结构变化及其运输过程。精细胞中线粒体数量的消减可通过自噬和泛素化等降解途径实现。为研究甲壳动物精子发生过程线粒体的泛素化降解机制,我们关注一种线粒体内膜蛋白Prohibitin(PHB)。该蛋白在进化上高度保守,它与哺乳动物的精子发生过程以及精子质量控制高度相关。在哺乳动物中它被发现作为泛素的底物,可能通过参与线粒体的泛素-蛋白酶体途径(UPP)来发挥作用。为研究PHB蛋白是否介导精子线粒体的泛素化途径,我们通过原核表达、重组蛋白纯化、家兔免疫以及抗体纯化等技术制备了物种特异性抗体。免疫印迹结果显示PHB蛋白在所检测组织中均有较高表达。通过免疫荧光实验检测了PHB蛋白在精子形成各时期的分布情况,结果显示在精子形成早中期顶体形成和精核变形过程中,PHB的表达量较高,说明PHB可能是通过维持线粒体的功能发挥作用,为精子形成过程中的顶体形成和细胞核形变提供充足的能量。PHB和多聚泛素FK2以及线粒体与FK2的共定位实验显示：精子形成早中期,PHB、多聚泛素FK2以及线粒体均分布在细胞的一侧,FK2信号比较弱,说明此时PHB和线粒体的泛素化水平比较低；在中后期,PHB、线粒体标记物以及FK2信号主要共定位于顶体帽以及细胞核一侧,FK2信号逐渐增强,表明多聚泛素化水平在中后期升高；成熟期精子中,PHB、线粒体标记物以及FK2共定位于顶体帽处。实验结果暗示在精子形成过程中PHB作为泛素化底物参与线粒体泛素化降解过程,或者多聚泛素链通过PHB为底物特异标记了线粒体。为进一步证明以上结论,使用shRNA干扰技术降低PHB表达和过表达技术增加PHB的表达。干扰组实验结果表明PHB表达量的降低,直接影响多聚泛素水平和线粒体状态。过表达实验结果表明PHB的大量表达使得多聚泛素化水平大幅提升。体外实验同样证明PHB作为多聚泛素的底物介导了线粒体的泛素化过程。
【关键词】：甲壳动物 精子发生 AFS KIFC 细胞凋亡 线粒体 泛素化
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q954.4
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 缩略表12-17
• 第一章 文献综述17-53
• 1.1 驱动蛋白KIFC1在精子发生过程中功能的研究概况17-25
• 1.1.1 引言17-18
• 1.1.2 精子发生18-21
• 1.1.2.1 哺乳类精子发生18-19
• 1.1.2.2 甲壳动物精子发生19-21
• 1.1.3 精子发生中的细胞骨架结构21-22
• 1.1.4 驱动蛋白在精子发生中的功能22-25
• 1.2 泛素化与精子发生25-37
• 1.2.1 泛素化25-26
• 1.2.2 精子发生26-27
• 1.2.3 精子发生过程中的泛素化27-33
• 1.2.4 泛素化在顶体形成中的作用33-34
• 1.2.5 精子在附睾中成熟过程中的泛素化34-35
• 1.2.6 泛素化与睾丸癌的关系35-36
• 1.2.7 结论与展望36-37
• 1.3 参考文献37-53
• 第二章 十足目游泳亚目秀丽白虾精子形成中的细胞骨架结构及动力学机制53-98
• 2.1 引言53-55
• 2.2 实验材料55-57
• 2.2.1 实验动物55
• 2.2.2 主要试剂及仪器55-57
• 2.3 实验方法57-73
• 2.3.1 秀丽白虾KIFC1基因克隆57-63
• 2.3.2 cDNA序列、多重比对、进化树构建以及蛋白结构分析63-64
• 2.3.3 半定量PCR检测基因在各组织中的表达64
• 2.3.4 原位杂交64-67
• 2.3.5 原核表达67-70
• 2.3.6 抗体制作及效价检验70
• 2.3.7 免疫印迹70-72
• 2.3.8 免疫荧光72-73
• 2.4 实验结果73-90
• 2.4.1 KIFC1序列分析73-76
• 2.4.2 KIFC1蛋白序列比对和系统进化分析76-77
• 2.4.3 KIFC1蛋白结构77-78
• 2.4.4 Kifc1 mRNA在不同组织中的表达78-79
• 2.4.5 精子形成中Kifc1基因的时空表达模式79-81
• 2.4.6 秀丽白虾KIFC1蛋白体外表达和蛋白纯化结果81-82
• 2.4.7 秀丽白虾KIFC1抗体效价检测结果82
• 2.4.8 秀丽白虾KIFC1蛋白在各组织中的鉴定82
• 2.4.9 秀丽白虾精子形成中KIFC1在细胞内的转运功能82-85
• 2.4.10 大鼠精子形成中的微管套结构85-86
• 2.4.11 KIFC1运输的“货物”86-90
• 2.5 讨论90-93
• 2.5.1 顶体构架体与微管套的比较90-91
• 2.5.2 KIFC1可能参与顶体发生和变形91-93
• 2.6 本章小结93
• 2.7 参考文献93-98
• 第三章 中华绒螯蟹精子发生过程中p53基因功能探索98-126
• 3.1 引言98-99
• 3.2 实验材料99-101
• 3.2.1 实验动物99
• 3.2.2 主要试剂及仪器99-101
• 3.3 实验方法101-111
• 3.3.1 中华绒螯蟹精巢p53基因克隆101-107
• 3.3.2 cDNA序列、多重比对、进化树构建以及蛋白结构分析107-108
• 3.3.3 半定量PCR检测基因在各组织中的表达108
• 3.3.4 原位杂交108-111
• 3.4 结果111-119
• 3.4.1 P53序列分析111-112
• 3.4.2 P53蛋白结构112-113
• 3.4.3 P53蛋白序列比对和进化分析113-115
• 3.4.4 P53 mRNA在不同组织中的表达115-116
• 3.4.5 精子发生过程中P53的时空表达116-119
• 3.5 讨论119-122
• 3.5.1 p53蛋白的特性描述120
• 3.5.2 p53 mRNA的组织表达120
• 3.5.3 P53在保护正常精子发生中的潜在功能,包括引发DNA修复和细胞凋亡120-122
• 3.5.4 p53在成熟精子中的潜在功能122
• 3.6 结论122
• 3.7 参考文献122-126
• 第四章 中华绒螫蟹精子发生过程中PHB介导的线粒体泛素化研究126-169
• 4.1 引言126-129
• 4.2 实验材料129-130
• 4.2.1 实验动物129
• 4.2.2 主要试剂及仪器129-130
• 4.3 实验方法130-142
• 4.3.1 原核表达130-133
• 4.3.2 抗体制作及效化检验133-134
• 4.3.3 免疫印迹134-136
• 4.3.4 免疫荧光136-137
• 4.3.5 体外转染137-142
• 4.4 结果142-159
• 4.4.1 重组载体构建142-143
• 4.4.2 Pet28a-PHB重组蛋白纯化143
• 4.4.3 抗体制备-抗体效价以及特异性检测143
• 4.4.4 中华绒螯蟹PHB蛋白在不同组织中的鉴定143-144
• 4.4.5 精巢中FK2(多聚泛素标记物)鉴定144-145
• 4.4.6 PHB在中华绒螯蟹精子形成不同时期的表达情况145-146
• 4.4.7 PHB与FK2在中华绒螯蟹精子形成不同时期的表达情况146-148
• 4.4.8 线粒体标记物与FK2在中华绒螯蟹精子发生不同时期的表达情况148-151
• 4.4.9 线粒体标记物与PHB在细胞中的定位对照151-152
• 4.4.10 shPHB体外干扰152-154
• 4.4.11 es-phb基因体外过表达实验154-155
• 4.4.12 shPHB138干扰后线粒体、PHB泛素化水平检测155-158
• 4.4.13 ES-PHB蛋白体外过表达对多聚泛素化的影响158-159
• 4.5 讨论159-163
• 4.5.1 PHB在甲壳动物精子顶体形成和细胞核形变中的作用160-161
• 4.5.2 在精子形成时期PHB介导了线粒体的泛素化161-163
• 4.6 本章小结163
• 4.7 参考文献163-169
• 第五章 总结与展望169-171
• 附件Ⅰ171-172
• 附件Ⅱ172-180
• 附件Ⅲ180-185

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 堵南山,薛鲁征,赖伟;中华绒螯蟹精子的研究 Ⅱ.精子发生[J];海洋与湖沼;1988年01期

2 林勤武,刘瑞玉,相建海;中国对虾精子的形态结构、生理生化功能的研究Ⅰ.精子的超显微结构[J];海洋与湖沼;1991年05期

3 林抒豪;石玉秀;韩芳;;细胞凋亡与真核细胞骨架蛋白相关性的研究进展[J];解剖科学进展;2015年02期

4 杨万喜;日本沼虾三种细胞器在精子发生过程中变化的研究[J];应用与环境生物学报;1998年01期

  本文关键词：十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：255975