特异腐质霉高效表达体系的建立及新型葡聚糖酶的功能鉴定

发布时间：2019-11-26 01:10

【摘要】：特异腐质霉具有强大的纤维素降解和纤维素酶分泌能力,因此在生物质能源、酿造工业、纺织工业及高效外源基因表达等领域具有良好的应用前景。但目前对该菌的研究多停留于胞外酶的纯化和相关酶基因的克隆表达,关于其成熟表达系统的研究却鲜有报道。本研究以特异腐质霉Y1为出发菌株,利用根瘤农杆菌介导的转化方法,成功构建了该菌的高效遗传操作体系。利用内源3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的启动子元件实现了外源基因,包括G418和潮霉素B的抗性基因,以及增强型绿色荧光蛋白编码基因在特异腐质霉中的功能性表达。利用纤维二糖水解酶NCE2启动子元件,成功实现了特异腐质霉HiBgl3A和Talaromyces leycettanus JCM12802 TeBgl3A在特异腐质霉中的分泌性表达。同时,我们对转化参数进行了优化,最终实现了超过300个转化子/106分生孢子的转化效率。在此基础上,利用T-DNA随机插入突变的方法建立了特异腐质霉的突变体库,并从中筛选得到了纤维素酶高产突变株T4。突变株T4的滤纸酶活、内切β-1,4葡聚糖酶酶活、纤维二糖水解酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力以及木聚糖酶活较野生型菌株均有了大幅度提升,分别提高了60%,440%,320%,41%和81%。继而通过克隆鉴定该突变株中T-DNA插入位点的侧翼序列,获得了两个与纤维素酶表达分泌可能相关的基因tdiD和proA。本研究为我们改良特异腐质霉菌株,优化纤维素降解酶系,使其成为高温中性纤维素酶的工业生产菌株奠定了良好基础,还可为实现异源基因在特异腐质霉的高效表达提供必要的技术保障。此外,我们还克隆鉴定了特异腐质霉中新型内切β-1,4-葡聚糖酶编码基因Hicel6C和β-1,3(4)-葡聚糖酶编码基因Hicel16A,成功实现了其在毕赤酵母中的异源表达,并对重组蛋白的酶学性质进行了研究分析。与大多数真菌来源的酸性内切葡聚糖酶不同,重组HiCel6C最适作用pH为6.5,具有较好的耐碱性,在pH8.0时仍具有98%的相对酶活力,在pH 9.0和10.0时,仍有61.2%和27.6%的相对活力。在pH 5.0-11.0的范围内,都具有良好的pH稳定性,37℃处理1 h后,仍保留80%以上的酶活力。HiCel6C最适反应温度为70℃,具有优良的热稳定性,60℃处理1h后,仍保留90%以上的酶活力。在70℃,pH 6.5条件下,以大麦葡聚糖为底物时,HiCel6C的Km值和Vmax分别为1.29 mg/mL和752μmol/min·mg。HiCel6C可以降解大麦葡聚糖、地衣多糖和羧甲基纤维素钠,却对昆布多糖无降解活性,表明其特异性的切割β-1,4-糖苷键。HiCel6C随机切割纤维寡糖内部的糖苷键,是一个典型的内切酶。HiCel6C的这些优良性质使其在许多应用领域,如生物质能源转化、纺织、啤酒酿造和造纸工业等领域都具有重要的应用价值。Hicell6A成熟cDNA全长861 bp,编码了286个氨基酸和一个终止密码子。HiCel16A包含一个N端20个氨基酸的信号肽序列和一个保守的GH16家族的催化结构域。我们成功实现了HiCel16A在毕赤酵母GS115中的异源表达。重组HiCel16A可以降解大麦葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖,却对羧甲基纤维素钠无降解活性,表明其HiCel16A是一个β-1,3(4)-葡聚糖酶。这是特异腐质霉中第一个得到功能鉴定的β-1,3(4)-葡聚糖酶。重组HiCel16A最适作用pH为5.5,最适反应温度为55℃。与大多数特异腐质霉来源的纤维素酶和半纤维素酶类似,重组HiCel16A在中性偏碱(pH 5-9)范围内具有较好的稳定性,37℃处理1 h后,仍保留90%以上的酶活力。在55℃,pH 5.5反应条件下,以大麦葡聚糖为底物时,HiCel16A的Km值和Vmax分别为0.91 mg·ml-1和1530 μmol·min-1·mg-1。 HiCel16A的优良酶学性质使其可以广泛应用于多种领域,如近年来报道的应用降解混合糖苷键的β-葡聚糖酶水解大麦和地衣生产生物燃料,应用β-1,3-葡聚糖酶防治植物的真菌病害等。
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Ｗｅｓｔ知ｅｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１0。被氧化物的出现明这是一种新型纤维素降解制。逡逑此外，还有一些真菌酶系组分也参与到纤维素的降解中。例如，删除粗糖逡逑脉抱菌中纤维二糖脱氨酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ－ｄ浊ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，邋ＣＤＨ）编码基因Ｃ诚ｉ－ｉ时，逡逑纤维素酶活力大幅下降。ＣＤＨ促进作用的发挥与ＧＨ６１蛋白的存在有关，这是逡逑一种与褐腐真菌中氧化还原酶通过产生径自由基攻击纤维素所不同的、直接由逡逑氧化酶作用于底物的纤维素氧化降解机制（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。向里氏木霉酶系逡逑中加入重组的ＣＤＨ时，葡萄糖磨酸的释放和半纤维素的降解得到促进（Ｂｅｙ邋ｅｔａｌ．，逡逑２０１１）。被命名为ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ的蛋白与纤维素酶也具有协同水解作用（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１１）。Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ具有典型的纤维素酶结构域组成模式及转录调控特化可使微逡逑晶纤维素粒径变小，，但检测不到还原糖的产生（Ｇｏｕｒｌａｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１３；邋Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ邋ｅｔ逡逑ａｌ．，２００２）。纤维素醇中的纤维素结合结构域在单独存在时，也可Ｗ通过改变结晶逡逑巧维素结构来促进后续的纤维素酶水解（Ｈａｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，２0ｎ）。逡逑ｂｅｔａ邋续逦户‘颗—？逡逑

我们检测了潮霉素Ｂ和Ｇ４１８对特异腐质霉在ＰＤＡ培养基中生长情逡逑况的影响。实验结果表明，ｄＯ帖／ｍＬ的潮霉素Ｂ和＾０帖／ｍＬ的Ｇ４１８可Ｗ逡逑完全抑制将异腐质霉的生长（图２－１邋）。因此，潮霉素Ｂ抗性基因（邸Ａ）和Ｇ４１８逡逑抗性基因均可作为特异腐质霉外源基因转化的筛选标记。逡逑Ｇｒｏｗｔｈ逦＋？？逦？？逦？逦－逦－逡逑０逦，邋．１化ｕｇ＇ｍｌ逦说俩？晵巧啼Ｉ。三户奶巧竹ｆ。山－逡逑ＰＤＡ＋Ｇ邋州邋ｅｔｉｃｉｎ逦ｉ逡逑说州邋＇．’，Ｓ逦－逦５的／ｍｌ逦１巧Ｓ巧＇Ｔｉｌ逦

本文编号：2565941