东亚飞蝗烟碱型乙酰胆碱受体调控蛋白鉴定与功能研究

发布时间：2019-12-02 01:38

【摘要】：烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是动物体内重要的配体门控离子通道,介导以乙酰胆碱为神经递质的快速兴奋神经传导。在人类和其他哺乳动物中,nAChRs与多种疾病相关,例如阿尔兹海默症、帕金森综合症、精神分裂症等。在昆虫中,nAChRs是新烟碱类、多杀菌素类等杀虫剂的作用靶标。在动物体内,nAChRs的功能依赖于其与许多蛋白质的相互作用,这些蛋白参与调控受体转录、翻译、折叠、组装、成熟、运输、定位等一系列合成关键过程或者直接调节其功能特性,如蛋白激酶A对昆虫神经元上nAChRs的调节作用影响细胞对杀虫剂的敏感性。因此,这些互作蛋白的研究对疾病治疗、杀虫剂抗性治理和新型杀虫剂开发都有深远意义。虽然nAChRs互作蛋白研究在脊椎动物中已经比较成熟和系统,但在昆虫中的研究相对较少,目前仅发现RIC-3 (resistant to inhibitors of cholinesterase-3)、Lynx、钠钾泵和一些蛋白激酶参与调节昆虫nAChRs功能。本文以东亚飞蝗为实验材料,通过神经细胞转录组测序,得到大量离子通道及nAChRs相关蛋白的序列信息。利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统,研究了东亚飞蝗Lynx蛋白对nAChRs功能调节作用的选择性。结合文献报道,选取分别参与nAChRs合成途径中组装、运输和聚集三个关键步骤的调控蛋白,ubiquilin-1、PICK1和CRELD2,利用背部不对称中央神经元(dorsal unpaired median neuron, DUM神经元)RNAi,结合荧光染料细胞膜电位检测方法及全细胞膜片钳技术,证实这3个蛋白参与昆虫nAChRs功能调控,ubiquilin-1和PICK1对受体表现出负调控作用,而CRELD2是受体的正向调控蛋白。一、东亚飞蝗神经细胞转录组昆虫神经细胞是神经系统的基本单位,细胞膜上分布着大量离子通道,细胞电生理活动以离子通道的开放和闭合为基础,通过控制钠、钾、钙、氯等离子的胞内外离子流来完成神经冲动传导,其中nAChRs不仅是中枢神经系统神经细胞上重要的配体门控离子通道,也是多类杀虫剂的作用靶标,因此神经细胞是研究nAChRs的优良材料,目前已得到广泛应用。本文通过比较东亚飞蝗和美洲大蠊腹神经索的外部特征以及二者通过常规酶解法获得的DUM神经元数量和细胞悬浮液状态,发现东亚飞蝗腹神经索脂肪少,易清理;经过酶解后的DUM神经元数量多,每条东亚飞蝗腹神经索可解离出28±5个DUM神经元,美洲大蠊仅解离出8±1个DUM神经元,且所得东亚飞蝗DUM神经元中细胞直径适合电生理实验的比例高;另外,东亚飞蝗DUM神经元细胞悬浮液杂质更少,对后续神经元的离体培养有利,因此选用东亚飞蝗神经系统作为本实验的研究材料。目前,东亚飞蝗已完成基因组测序,但基因信息尚未完全公布,神经功能相关的基因信息较少,在本研究之前只能搜索到4个nAChR亚基的全长,因此本章用酶解法和机械解离法对东亚飞蝗中枢神经系统的神经细胞进行分离,然后利用细胞密度梯度离心技术分离纯化神经细胞,得到分离纯化东亚飞蝗神经细胞的细胞密度梯度分离体系,使离心后神经细胞比例达到80%左右。对纯化后的神经细胞进行转录组测序,得到大量神经系统特异表达基因的信息,包括序列不同的11个nAChR亚基,3个γ-氨基丁酸门控离子通道亚基和7个谷氨酸门控氯离子通道基因片段,另外搜索到3个蛋白序列不同的Lynx,分别命名为Loc-lynx1 (KP694213)、Loc-lynx2 (KP694214)和Loc-lynx3(KP694215),及可能与nAChRs结构和功能有关的蛋白,如14-3-3蛋白、RIC-3、ubiquilin-1、CRELD2、PICK1 等。利用实时荧光定量PCR构建Lynx、ubiquilin-1、PICK1和CRELD2对应基因的组织表达谱发现,lynx基因特异性地在神经系统中高表达,说明其对nAChRs的调节可能是特异的;另外3个基因组织分布广泛,说明它们可能参与更多生物过程。二、东亚飞蝗Lynx蛋白对烟碱型乙酰胆碱受体调节作用的选择性在过去几十年的研究中发现,许多蛋白在nAChRs的合成和功能中扮演着重要角色,根据受体与相关蛋白之间的互作模式,这些互作蛋白可以分为分子伴侣、调控蛋白和调节蛋白。本实验室前期对褐飞虱神经系统中Lynx的作用机制进行了初步分析,发现该类蛋白对nAChRs亚型具有选择性。本文在东亚飞蝗神经细胞转录组中,鉴定出3个不同的Lynx蛋白,并对该类蛋白调节nAChRs功能进行了系统研究,包括对不同的激动剂、结合位点和调节模式的选择性。在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中,Lynx蛋白显著增大激动剂诱导的重组nAChRs Locα1/rβ2和Locα2/rβ2的最大电流值,但不改变受体对激动剂的敏感性。Loc-lynx 1和Loc-lynx3仅调节Locα1/rβ2的电流响应,而Loc-lynx2特异性地调节Locα2/rβ2,因此说明Lynx的调节对nAChRs亚型具有选择性。当以吡虫啉和epibatidine为激动剂时,Loc-lynx1分别使Locα1/rβ2电流上升4.31倍和4.18倍,Loc-lynx3使电流上升6.47倍和5.82倍;当以乙酰胆碱为激动剂,Loc-lynx1和Loc-lynx3分别使电流增强3.18倍和2.93倍,因此Loc-lynx1和Loc-lynx3对吡虫啉和epibatidine诱导的内向电流的调节作用强于乙酰胆碱的,说明Lynx对不同激动剂诱导的电流的调节能力不同。放射性配基结合实验结果表明,3个Lynx蛋白中,仅Loc-lynx1显著增加了Locα1/rβ2对[3H]epibatidine 的最大结合量,因此 Loc-lynx1 对 nAChRs 具有与 Loc-lynx2 和Loc-lynx3不同的调节模式。综上所述,这3个Lynx蛋白是nAChRs的调节蛋白,并且对nAChRs的调节作用具有选择性,具体表现在三方面:对nAChRs亚型的选择性、对不同激动剂的选择性和不同的Lynx具有不同的调节模式。三、东亚飞蝗烟碱型乙酰胆碱受体调控蛋白鉴定与功能研究已有研究发现,蛋白激酶可以改变nAChRs对杀虫剂的敏感性,说明nAChRs、nAChRs互作蛋白及杀虫剂敏感性之间相互关联,本实验室前期研究发现褐飞虱nAChR α8亚基表达水平下调导致对吡虫啉的抗性,因此鉴定新的昆虫nAChRs调控蛋白对杀虫剂抗性机理研究、抗性治理和新型杀虫剂开发十分必要。本文利用细胞RNAi技术,干扰编码ubiquilin-1、CRELD2和PICK1蛋白的基因在东亚飞蝗DUM神经元中的表达,然后利用电压敏感性阴离子染料DiBAC4(3)检测激动剂引起的细胞膜电位变化和全细胞膜片钳技术记录激动剂诱导的电流反应,研究ubiquilin-1、CRELD2和PICK1对nAChRs的调控作用。研究结果表明,当DUM神经元转染靶标基因siRNA48h时,ubiquilin-1、CRELD2和PICK1 mRNA的干扰效率分别为79.4%、73.4%和85.6%,达到比较理想的干扰效果。相同剂量吡虫啉处理下,ubiquilin-1或PICK1被干扰的DUM神经元荧光强度显著高于对照组,分别为对照组的1.47倍和1.48倍,说明干扰后细胞膜电位变化大于对照组;与之相反,当CRELD2被干扰后,DUM神经元荧光强度显著小于对照组,仅为对照组的72.53%,说明其膜电位变化小于对照组。膜片钳记录电流结果与荧光观察结果一致,乙酰胆碱和吡虫啉诱导ubiquilin-1或PICK1干扰组DUM神经元产生的内向电流显著大于对照组,而CRELD2干扰组神经元的电流显著小于对照组,因此这3个蛋白的表达量下降影响神经元细胞膜上nAChRs对激动剂的响应。结合膜电位和电流变化结果推测,这3个蛋白是东亚飞蝗nAChRs的调控蛋白,并且ubiquilin-1和PICK1表现出负调控作用,而CRELD2对受体具有正向调控作用。另外发现,低剂量(0.1mM)激动剂的电流对α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin, α-Bgt)完全不敏感,而较高剂量(10mM)诱导的部分电流对α-Bgt敏感,另一部分不敏感,因此东亚飞蝗DUM神经元中存在两种药理学特性不同的nAChRs,即α-Bgt敏感型和α-Bgt不敏感型nAChRs。并且0.1 mM激动剂处理下这3个蛋白被干扰均导致内向电流发生显著变化,但10 mM激动剂处理下仅ubiquilin-1干扰组DUM神经元产生的α-Bgt敏感电流显著大于对照组,而PICK 1和CRELD2干扰组与对照没有显著差异,说明ubiquilin-1同时调控α-Bgt敏感型和α-Bgt不敏感型nAChRs,而PICK1和CRELD2仅调控α-Bgt不敏感型nAChRs.
【图文】：

神经元（ｐｒｏｘｉｍａｌｂｒａｎｃｈｉｎｇ邋１邋ｎｅｕｒｏｎ）、近端分支邋３邋神经元（ｐｒｏｘｉｍａｌｂｒａｎｃｈｉｎｇ邋３邋ｎｅｕｒｏｎ）、逡逑对称神经元（ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ邋ｎｅｕｒｏｎ）、致密模糊神经元（ｆｏｚｚｙ邋ｃｏｍｐａｃｔ邋ｎｅｕｒｏｎ，ＦＣ－ｎｅｕｒｏｎ）逡逑和曲折花边神经元（ｒｉｃｋ邋ｒａｃｋ邋ｎｅｕｒｏｎ，ＲＲ－ｎｅｕｒｏｎ）（图１－１）。前三种神经元是体内的逡逑投射神经元，剩余三种神经元属于无长突局部中间神经元［１１］。２００３年，Ｐａｒｋ等人发现逡逑家蚕（５0７＾＿ｙｘｍｏｒ／）的触角叶神经细胞从蛹期第二天可以观察到四种形态学不同的神逡逑经细胞，分别是单极、双极、多极和投射神经元（图１－２），它们在原代培养中长成形逡逑态成熟的神经元细胞大约需要两周时间［１２］。单极神经元是最常见的类型，具有易观察、逡逑完全生长的特点（图１－２Ａ）。双极神经元在培养过程中可以生长成其他类型，比如投逡逑射神经元（图１－２Ｂ）。多极神经元从胞体伸展出来需要一些过程，且不总是表现出投逡逑射神经元轴突长的形态特征（图１－２Ｃ和Ｄ）。与其他神经元相比，，投射神经元具有一逡逑个类似轴突的结构以及丰富的分叉的终树突（图１－２Ｅ１和Ｅ２）。逡逑２逡逑

重要实验材料和热点［４７’４８’邋６Ｑ＇６４］。逡逑急性分离的美洲大蠊ＤＵＭ神经元的典型形态是梨形，具有球形胞体和轴突，细胞逡逑膜完整光滑，形态饱满（图１－３）。根据胞体大小和轴突长度的不同（轴突长度／胞体直逡逑径）大致可分为三类：第一种比值〈１的神经元（图１－３Ａ），数量最多，占大约６０％，其逡逑中直径５０－６０｜ａｍ的神经元是电生理实验研宄的最佳材料；第二种１Ｓ比值＜２大小的神经逡逑元比例约为２０％邋（图１－３Ｂ）；第三种，比值之２的神经元约占１０％邋（图１－３Ｃ），这类细胞逡逑直径多小于４０邋ｐｍ，轴突较长，电压不易钳制，因此不应用于电生理实验［６５］。急性分逡逑离的ＤＵＭ神经元只具有一个初级的轴突，经过体外培养后的神经元大多具有多极轴逡逑突，且最终的轴突数量与初级的轴突长度呈相关性，随着初级轴突长度的增加，神经逡逑元培养过程中生长出的极数减少（图１－４）邋ＰＩ。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑＾邋＊邋▲、邋＇邋＼邋＇逡逑ｏ邋0■邋．逡逑，逦■？逦ｅ逡逑？邋？邋＇邋￣邋．邋—邋．邋—逡逑图１－３美洲大蠊急性分离ＤＵＭ神经元Ａ：轴突长度／胞体直径小于１的ＤＵＭ神经元。Ｂ：轴突逡逑长度／胞体直径大于等于１小于２的ＤＵＭ神经
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q966


本文编号：2568590