两种蜘蛛毒素的活性机制和应用基础研究

发布时间：2020-01-26 20:39

【摘要】：海南捕鸟蛛(Haplopelma hainanum[Selenocosmia hainana])主要分布于我国南方地区的山林地带,体型较大,能够捕食鸟类和小型哺乳动物。海南捕鸟蛛毒素-I(HNTX-I)是分离自海南捕鸟蛛毒液的一种神经毒素,首先通过电刺激蜘蛛螯肢采集毒液,经过冷冻干燥之后得到干粉,然后采用阳离子交换和反相高效液相色谱分离纯化得到单一组分HNTX-I。采用膜片钳技术鉴定了该毒素分子对中电导钙离子激活钾通道(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel,IK)门控特性的影响。HNTX-I含有33个氨基酸残基,6个半胱氨酸(Cys)形成3对二硫键,一级序列包含两个相邻的半胱氨酸,二硫键配对方式为I-IV、II-V、III-VI,相对分子质量为3607.1 Da,是海南捕鸟蛛毒液中丰度最高的组分。HNTX-I可以激活IK通道的开放,IK通道在血管上皮细胞的舒张过程中发挥重要作用,其功能受损可能会导致高血压等心脑血管疾病的发生。并且HNTX-I对于大鼠背根神经节上的电压门控钠通道、钙通道和HEK293T细胞上异源表达的电压门控慢激活延迟整流钾通道均无明显效果;对于同源性较高的小电导(small-conductance calcium-activated potassium channel,SK)钙离子激活钾通道,饱和剂量的HNTX-I也只能产生微弱的激活效果,而对同一家族的另一成员——大电导(big-conductance calcium-activated potassium channel,BK)钙离子激活钾通道,HNTX-I则几乎没有作用。同时,通过小鼠膈肌-膈神经标本和毒理学的研究,发现hntx-i不会阻断神经信号的传导,也没有明显的致死性。实验证明了hntx-i能够专一性激活ik通道,并没有产生明显的毒副作用。敬钊缨毛蛛(chilobrachysguangxiensis[chilobrachysjingzhao])是发现于我国海南省的一种捕鸟蛛,敬钊缨毛蛛毒素-v(jztx-v)是从该蜘蛛毒液中分离得到的一种广谱神经毒素,能够抑制大多数的电压门控钠通道和钾通道,并且已有实验证明,该毒素能够和磷脂发生相互作用。本研究采用固相多肽合成得到jztx-v毒素,并将合成的线性产物氧化复性,再采用罗丹明b(rhodamineb)荧光标记。通过膜片钳实验和圆二色谱(circulardichroism,cd)检测,结果表明带有荧光标记的jztx-v(r-jztx-v)的电生理活性和二级结构基本和天然毒素分子相同,从而证明荧光标记并未对毒素分子的功能和结构造成显著影响。我们通过毒素损耗实验证明了jztx-v能够和活体细胞膜发生相互作用,然后使用全内反射荧光显微镜(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,tirfm)追踪了带有荧光标记的单个jztx-v毒素分子在活细胞膜表面运动的轨迹。通过轨迹的分析,我们发现了单个毒素分子在细胞膜表面主要存在三种运动模式:即无规则的快速活动、限定区域的低速运动和相对于膜表面静止。基于上述实验,我们建立了一种直观研究毒素分子和细胞膜相互作用的方法,并初步阐述了毒素分子在细胞膜表面的具体运动情况,为研究毒素分子与膜上离子通道的相互作用奠定了基础。综上所述,本研究发现了HNTX-I对于IK通道的激活效果,并探讨了二者作用的机制,这是首次发现IK通道的多肽类激活剂。我们利用JZTX-V研究单个毒素分子与活体细胞膜表面的相互作用,是第一次在活细胞体系运用单分子荧光技术研究毒素分子的运动模式。
【图文】：

亚单位,感受元件,不相连,通道

图 1-1 电压依赖性钾通道包含 4 个不相连接的亚单位，构成的四聚体通道，其中每个亚单位都含有 1 个带电荷的电压感受元件（S4）。电压依赖性通道蛋白具有 3 种主要功能,一是离子通透功能 ,二是门

通道结构

图 1-2 （a）Kir通道结构简图。每个亚基包含两个跨膜螺旋（M1 和M2）、一个含有孔隙-螺旋（P）的孔道形成区域和由氨基（N）和羧基（C）末端形成的胞质域。（b）Kir通道在胞外形成四聚体结构。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q51

【相似文献】