青藏高原特有属固沙草属的物种界定与遗传多样性研究

发布时间：2017-03-20 11:10

  本文关键词：青藏高原特有属固沙草属的物种界定与遗传多样性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：青藏高原被誉为“世界屋脊”和“地球第三极”,其与毗邻地区一起构成全球物种多样性中心之一。该地区植物种类丰富,特有植物物种比例高,一直是物种界定、物种进化和生物多样性研究的热点地区之一。固沙草属Orinus Hitchcock(禾本科Poaceae)是青藏高原及其邻近地区的一个高山特有属,是在该地区极端沙地环境下生长的关键或唯一类群,作为野生牧草和适应极端环境植物资源,具有重要的生态价值。自该属确立以来,先后发表了固沙草(O.thoroldii)、鸡爪草(O.anomala)、青海固沙草(O.kokonorica)、西藏固沙草(O.tibeticus)、高秆固沙草(O.alticulmus)和长颖固沙草(O. longiglumis)6个物种,但这些物种的形态变异复杂多样,种间界限模糊,能否作为独立的分类学物种至今未见任何报道。因此,固沙草属为研究高原极端沙地环境下植物物种界定、物种分化和新物种形成提供了理想模型。另一方面,固沙草属植物遗传多样性、遗传结构和种内遗传分化的研究目前尚属空白。本文在全面野外调查基础上,综合利用形态统计和DNA条形码分子标记在居群水平上对固沙草属所有物种进行物种界定和分类研究,以期为今后研究青藏高原地区植物物种界定和物种形成提供一个好的典型范例。同时,采用AFLP分子标记检测了该属的遗传多样性、遗传结构和种内遗传分化,旨在为固沙草属种质资源的保护和利用提供科学依据。主要研究结果及结论如下：(1)固沙草属植物形态变异与物种界定外稃、颖片、叶鞘和叶片被毛状况,小穗颜色,以及根状茎鳞片的有无是固沙草属物种划分的最主要依据。这些外部形态特征在先前确认的鸡爪草、青海固沙草和高秆固沙草3个物种的居群内和居群间均存在广泛变异；同样,在先前确认的固沙草、西藏固沙草和长颖固沙草3个物种的居群内和居群间也均存在广泛变异,但在这两组类群间的变异则比较稳定。通过对先前确认的固沙草属6个物种90个居群673个个体的植株高度、旗叶长宽比、叶片和叶鞘被毛状况、圆锥花序长度、小穗长度、小穗颜色、每小穗小花数、颖体长度、颖体被毛状况、外稃长度、外稃被毛状况、根状茎有无鳞片等13个具有较大分类价值的形态性状特征构成的矩阵进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),发现所有检测个体在PCA分析中明显聚为3组：第1组包括鸡爪草、青海固沙草和高秆固沙草的33个居群216个个体,组内没有发现以种或居群为单元的亚组；第2组包括固沙草、西藏固沙草和长颖固沙草的41个居群362个个体,也没有形成亚组；而第3组则由鸡爪草和固沙草剩余的16个居群95个个体组成,以根状茎无鳞片、每小穗常含5-9小花显著不同于前2组。基于这些研究结果,本文支持将固沙草属原划分的6个物种重新界定为固沙草(O.thoroldii)、鸡爪草(O.anomala)和居间固沙草(O.intermedia)3个物种。即青海固沙草和高秆固沙草均归并到鸡爪草中,作为鸡爪草的异名；西藏固沙草和长颖固沙草也均归并到固沙草中,同样作为固沙草的异名；第3组类群作为单独的一新物种(居间固沙草)处理。(2)DNA条形码与固沙草属植物物种界定本文用不同类型的DNA条形码片段(matK、rbcL、trnH-psbA、nITS)对固沙草属植物进行了物种界定,结果显示无论单个cpDNA条形码片段或3个cpDNA条形码组合的片段对固沙草属物种的鉴别率较低；而nrITS条形码片段对固沙草属物种的鉴别率较高,其结果与固沙草属的形态学分类结果一致,支持将该属划分为3个物种,说明nrITS可作为界定近缘物种的一个关键条形码片段；而单一cpDNA条形码片段与nrITS片段的组合可以显著提高固沙草属物种鉴定的分辨率,尤其是trnH-psbA+nrITS和rbcL+nrITS两个组合片段对固沙草属物种的鉴别率高达100%。基于cpDNA数据和nrITS数据分别构建的系统发育树和NETWORK图显示,固沙草属所有物种为一单系群。基于cpDNA数据构建的系统发育树显示,先前确认的6个固沙草属物种聚成两个稳定、高支持率的分支Ⅰ、Ⅱ,分支Ⅰ是由分布于青藏高原东部的鸡爪草、青海固沙草和高秆固沙草以及东南部的鸡爪草和固沙草构成,分支Ⅱ则是由来源于青藏高原西部的固沙草、西藏固沙草和长颖固沙草组成；而基于nrlTS序列数据构建的系统发育树则显示,6个先前确认的固沙草属物种严格地形成四个稳定且高支持率的分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),其中分支Ⅳ与基于cpDNA数据划分出的分支Ⅰ物种构成完全相同,分支Ⅰ主要由青藏高原东部的鸡爪草、青海固沙草和高秆固沙草构成,分支Ⅱ主要是由源于四川西部的鸡爪草和固沙草组成,分支Ⅲ则主要由西藏昌都地区的两个固沙草居群所构成；分支Ⅱ和Ⅲ的DNA序列与分支Ⅰ和Ⅳ的序列具有明显叠加位点,分支Ⅱ和Ⅲ与分支Ⅰ之间共享7个突变核苷酸,与分支Ⅳ间仅共享2个突变核苷酸,并且分支Ⅲ与分支Ⅳ之间有5个特有共享突变核苷酸,同时结合形态学研究结果,认为分支Ⅱ和Ⅲ应该作为一单系群而非并系群看待。DNA条形码对固沙草属物种界定的结果与基于形态学分类获得的结论是一致的。(3)固沙草属植物的遗传多样性和遗传结构本文从64对AFLP引物组合中筛选8对多态性较高的选择性引物,分别对基于形态和DNA条形码重新界定后的固沙草20个居群98个个体、鸡爪草19个居群94个个体以及居间固沙草9个居群39个个体,共计48个居群231个个体进行AFLP扩增分析。结果显示：固沙草属3个物种中,居间固沙草的遗传多样性最高,固沙草的遗传多样性最低,鸡爪草的遗传多样性居于两者之间；固沙草和鸡爪草问的遗传分化系数FST值为0.45657,固沙草和居间固沙草间的遗传分化系数FST值为0.44090,鸡爪草与居间固沙草间的遗传分化系数FST值为0.34960,表明3个物种间存在显著的遗传分化。同时,分子方差分析(AMOVA)表明,3个物种间的遗传变异为30.04%,居群间的遗传变异为13.31%,居群内的遗传变异为56.65%,居群内遗传变异高于居群间遗传变异。STRUCTURE结果表明,三个物种之间存在显著的遗传分化。此外,UPGMA聚类分析结果显示,当Simple Matching相似系数为0.776时,可将固沙草属48个参试居群分成3个大分支,这进一步支持了前面以形态学和DNA条形码为依据对固沙草属所作的物种界定的正确性和准确性。
【关键词】：青藏高原 固沙草属 物种界定 DNA条形码 遗传多样性
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949;Q943
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-12
• 第1章 引言12-32
• 1.1 经典植物分类学与物种界定12-15
• 1.2 DNA条形码与物种界定15-17
• 1.3 基因流与物种界定17-18
• 1.4 遗传多样性18-25
• 1.4.1 遗传多样性概念及研究意义18-19
• 1.4.2 遗传多样性检测方法及应用19-25
• 1.4.3 遗传多样性分析方法25
• 1.5 研究对象—固沙草属简介25-29
• 1.5.1 固沙草属分类学研究现状26-27
• 1.5.2 固沙草属植物研究中存在的问题27-29
• 1.6 本研究的目的和意义29-32
• 第2章 固沙草属的形态变异与物种界定32-50
• 2.1 野外考察与居群采样32-38
• 2.2 形态学性状的观察、测量和分析38
• 2.3 种内和种间的形态变异38-44
• 2.4 形态分化与物种界定44-50
• 第3章 DNA条形码与固沙草属物种界定50-80
• 3.1 材料和方法51-62
• 3.1.1 固沙草属样品采集51-57
• 3.1.2 实验试剂、器材及溶液配置57-58
• 3.1.3 总DNA提取、PCR扩增和测序58-60
• 3.1.4 数据分析60-62
• 3.2 分析结果62-72
• 3.2.1 DNA条形码对固沙草属物种的鉴别能力62-65
• 3.2.2 基于DNA条形码的固沙草属物种界定65-72
• 3.3 讨论72-80
• 3.3.1 DNA条形码对固沙草属物种界定的贡献72-76
• 3.3.2 固沙草属的物种界定和系统发育关系76-80
• 第4章 基于AFLP分子标记的固沙草属遗传多样性研究80-106
• 4.1 材料与方法80-88
• 4.1.1 材料80-83
• 4.1.2 相关试剂与仪器83
• 4.1.3 主要试剂配置83-84
• 4.1.4 实验方法84-87
• 4.1.5 数据处理与分析87-88
• 4.2 结果与分析88-101
• 4.2.1 DNA提取质量88-90
• 4.2.2 酶切与预扩增效果90-91
• 4.2.3 选择性扩增91-94
• 4.2.4 AFLP扩增产物的多态性94-96
• 4.2.5 遗传多样性分析96-97
• 4.2.6 遗传结构与分化97-99
• 4.2.7 聚类分析99-101
• 4.3 讨论101-106
• 4.3.1 影响AFLP实验成功的主要因素101-103
• 4.3.2 AFLP分子标记用于固沙草属遗传多样性研究的可行性103
• 4.3.3 固沙草属的遗传多样性103-104
• 4.3.4 种内和种间遗传分化104-106
• 第5章 结论与展望106-108
• 5.1 主要结论106-107
• 5.2 展望107-108
• 参考文献108-130
• 致谢130-132
• 攻读博士学位期间的研究成果132

【共引文献】

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