粟酒裂殖酵母DJ-1同源蛋白功能研究及PPR蛋白缺失引起的细胞絮凝与凋亡的机制研究

发布时间：2020-02-09 10:03

【摘要】：本文由两部分工作组成,第一部分是对粟酒裂殖酵母DJ-1同源蛋白的功能进行的研究,第二部分是对PPR蛋白(pentatricopeptide repeat proteins)的缺失引起的细胞絮凝与细胞凋亡的机制进行的研究。帕金森病相关蛋白DJ-1参与了细胞中众多不同的加工过程,包括羰基化合物的脱毒反应,细胞自噬以及氧化应激等。DJ-1同源蛋白在生物界的分布非常的广泛,它的众多参与各种不同应激反应的同源蛋白共同组成了一个蛋白超家族。粟酒裂殖酵母(chizosaccharomyces pombe)含有六个DJ-1同源蛋白,我们将其分别命名为Hsp3101-Hsp3105和Sdj1。在本研究的前半部分工作中,我们对S. pombe的DJ-1同源蛋白的功能及其在稳定期受到的调控进行研究。本部分所开展的工作和研究结果有：(1)通过检测高表达酵母DJ-1同源基因对野生型S. pombe以及△Spglol的α-羰基化合物抗逆性影响,我们发现S. pombe的Hsp3101, Hsp3102以及Sdj1, S. cerevisiae的HSP31具有乙二醛酶Ⅲ的活性,高表达时能够增强野生型S. pombe以及ASpglol应对丙酮醛和乙二醛的能力。(2)通过Western blot技术,我们检测了hsp3101-hsp3105缺陷菌以及sdjl缺陷菌中CFP-Atg8的加工情况,同时利用荧光显微镜观察了缺陷菌中GFP-Atg8在自噬体组装位点(PAS)处的定位情况,我们发现S. pombe的Hsp3102,Hsp3104, Hsp3105和Sdj1蛋白与细胞的自噬反应有关联,并且S. pombe所有的DJ-1同源蛋白都参与了Atg8蛋白在自噬体组装位点PAS处的正常定位。(3)以slyl缺陷菌和atfl缺陷菌为载体,通过Western blot技术检测S. pombe的DJ-1同源蛋白在稳定期的丰度,发现稳定期表达的S. pombe DJ-1同源蛋白在sty1缺陷菌和atf1缺陷菌的含量受到了明显的影响,说明S. pombe的DJ-1同源蛋白在稳定期的表达受到了Styl和Atfl的调控。PPR蛋白是最近发现的一类广泛存在于真核生物界,调控线粒体和叶绿体基因表达的RNA结合蛋白。主要功能是参与细胞器RNA的剪接、编辑、切割、稳定或者是调控其翻译。在本研究中,我们发现敲除了S. pombe的ppr基因会导致缺陷菌出现细胞絮凝和细胞凋亡现象。通过qRT-PCR检测缺陷菌的絮凝因子以及细胞壁重构酶结构基因的表达情况,发现ppr3, ppr4, ppr6, ppr10基因的缺失会导致部分絮凝因子以及细胞壁重构酶的高表达,进而引起细胞出现絮凝表型。而通过存活率检测,结合细胞核的DAPI染色,线粒体染色以及对各个ppr缺陷菌的ROS检测,发现ppr3, ppr4, ppr6, ppr10基因的缺失会导致缺陷菌线粒体受损,细胞产生大量活性氧和过量的铁离子进而导致细胞出现凋亡现象。
【图文】：

图１．２邋ｑＲＴ－ＰＣ民分析＆邋／ｗｗＡｅ的／ｗ如／口和吻／的表达［２７］逡逑－邋ｎ逡逑

图１．５酵母宏自嗤的过程［５０］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．５邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ邋ｉｎ邋ｙｅａｓｔ［５０］逡逑．．
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q936

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本文编号：2577781