酶法生产S-腺苷蛋氨酸

发布时间：2020-02-12 10:02

【摘要】：S-腺苷蛋氨酸(SAM)是由意大利人Cantoni于1953年发现的。它广泛存在于各种生物体内,参与体内40多种生化反应,在蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成过程中起着重要作用。S-腺苷蛋氨酸是一种重要的代谢中间体,对机体代谢活动的正常进行起着至关重要的作用。SAM是由底物L-甲硫氨酸(L-Met)和腺苷三磷酸(ATP)在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosyl-L-Methionine Synthetase, EC 2.5.1.6)作用下合成的。SAM目前主要用于医药行业,在临床医学上表现出优秀的应用价值,可用于肝脏、神经系统、骨关节炎、性功能障碍及癌症等疾病的治疗。目前生产SAM主要有微生物发酵法、化学合成法和酶促转化法。化学合成法分离纯化困难,成本高；微生物发酵法是目前SAM的主要生产方法,主要是酵母细胞发酵生产SAM,但是分离纯化工艺复杂,生产周期长；酶促转化法是目前生产SAM的研究热点,与其他两种方法相比,酶促转化法具有反应时间短、转化率高、分离纯化容易、对环境友好等优点。但由于生物体内SAM合成酶含量比较低、酶活不高,且稳定性较差,所以克隆出过表达、酶活高、稳定性好的SAM合成酶是酶促转化法合成SAM的关键。本论文以大肠杆菌(Escherichia Coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)基因组为模板扩增出SAM合成酶基因MetK、MATTt,以质粒pET22b (+)为载体构建重组质粒,以大肠杆菌BL21 (DE3)为宿主菌构建高产SAM的重组菌,实现了SAM合成酶的高效表达,并对培养条件、反应条件及酶学性质进行了研究；针对嗜热菌来源的SAM合成酶MATTt进行了固定化研究,将其固定在了碳纳米管上并对固定化后的SAM合成酶进行了表征；嗜热来源的MATTt进行了酶分子结晶及其结构解析,初步揭示了其热稳定的机理,为酶法生产SAM提供了有价值的参考。本论文具体研究内容如下：1、以大肠杆菌染色体DNA为模板,扩增得到SAM合成酶基因metK。将所得基因整合到载体pET22b (+),利用T7强启动子进行转录,以E.coli BL21 (DE3)为表达菌株,构建出了具有高效表达SAM合成酶的基因工程菌,实现了SAM合成酶基因在大肠杆菌中过表达,计算得metK酶的酶活为33.42 U/L(相对于发酵液体积),是空质粒酶活的123.70倍。对metK酶进行培养条件的优化：最适碳源为乳糖,最适氮源为尿素；诱导剂IPTG添加量为0.25‰,诱导时机为OD600值为0.5左右,诱导时间为6小时。优化了该酶的反应条件：最适反应温度为70℃；最适缓冲液(即pH值)为pH值8.0的Tris-HCl缓冲液；最适离子为Mg2+离子：最适酶量为催化10mmol/L的ATP和L-Met时,需要的最适酶量为4g/L; ATP为此酶促反应的主要抑制性底物。对酶热稳定性进行了研究：该酶在70℃保存5小时,酶活力保留80%左右,当保存15小时时,酶活力只存留15%左右,到25小时迅速下降至5%左右,保存30小时后几乎没有酶活。研究了酶动力学参数,结果Vmax为0.07 mM/min, ATP的Km值为4.13mM, L-Met的Km值为2.20mM。2、构建了来源于嗜热菌(Thermus thermophilus HB27)的含SAM合成酶基因的重组质粒pET22b-MATTt。在E.coli-B121(DE3)中实现了SAM合成酶基因MATTt的过表达,并用镍柱亲和层析纯化了该酶。计算得MATTt酶的比酶活为120.5 U/g,酶活为12.70 U/L。研究了MATTt的酶学性质：MATTt酶反应动力学表明结果Vmax为0.84μmol/min/mg, ATP的KM 4.19 mM, L-Met的KM为1.2 mM,与来源于Thermococcus Kodakarensis的同为嗜热SAM合成酶的TkMAT相似。结构稳定是该酶最突出特点。由圆二色谱图得出MATTt酶在pH值为5-10之间,结构稳定。热稳定性方面,70℃条件下保持24小时,酶活几乎没有损失。保存36小时后酶活仍保留60%。考察了MATTt的最适反应条件。该酶在较广的温度范围内.(30℃到90℃C)表现出催化活性。酶活随着反应温度的升高而升高,在80℃催化活性表现最高；MATTt在缓冲液pH值为6-11之间有活性,pH值为8.0时活性最大；发现该酶对Zn2+显示离子偏好性。应用功能化改造的多壁碳纳米管(MWCNTs)为载体对嗜热来源的SAM合成酶MATTt进行固定化,催化SAM合成。并对固定化酶进行表征。经过固定化MATTt酶经过4批次反应酶活保留80%。3、确定了MATTt蛋白的多个结晶条件,获得了可用于X射线衍射的MATTt蛋白晶体,并运用分子置换法解析其结构。通过对MATTt与metK的结构比较,发现二者的主要区别在于之前报道的‘'disordered loop"上,与大多数结构不同的是,MATTt中这段loop区的密度很好,其中的氨基酸残基可以全部确认。从目前已经解析的结构来看,MATTt的这段loop无论与metK这段完整的结构或有缺陷的结构相比,都存在着较为明显的构象差异,由此推测这段区域极有可能是二者热稳定性不同的主要原因。
【图文】：

结构图,模拟空间,结构图

动力学研巧思示，，环的开放运动只有１0’２秒，比化学反应时的变化要快１０逡逑倍。运用定点旋转标记方法对环与底物的关系进斤研究，结果证明：环的运动是蛋白逡逑质的固有性质而不是严格的配体调节，模拟空间结构如图１－６所示。逡逑姦逡逑Ｄ１０７ＲＩ逦？邋＊邋＊户、心＾邋／朵逡逑＇忽诗媭p浩义稀鲥危慑巍义稀我澹义贤迹保跺澹樱粒秃铣纱啄Ｄ饪占浣峁雇煎义希疲椋纾保跺澹樱椋恚酰欤幔簦椋铮铄澹铮驽澹螅穑幔悖邋澹螅簦颍酰慊颍邋澹妫铮蝈澹樱粒湾澹螅恚瑁澹簦幔螅邋义希保矗车鞍字世嘉峁寡芯垮义衔烁徊降牧私猓樱粒秃铣擅傅淖饔没恚疚亩运婕暗模樱粒秃铣衫业鞍族义辖锪死嘉峁沟牟舛ǎ饕捎茫厣湎呔逖苌浞∣喍愿玫鞍字实模任⑻褰峁菇义闲胁舛āＯ旅娼愿髦值鞍字识峁共舛ê驮げ獾姆椒ń芯咛遄凼觥ｅ义希保矗常钡鞍字剩游峁乖で煞椒ㄥ义希惹暗扒芍式峁苟ゲ庥校戎址椒ǎ捍油芳扑惴ā⑼唇７ê驼蹧o识别法。从头逡逑１３逡逑

序列,重组质粒,条带,质粒

逡逑进行双酶切的结果应该是Ｈ５２ｂｐ和＾ＯＯｂｐ的两条条带。电泳结巧如图２－７所示，在逡逑ｌＯＯＯｂｐ和２０００ｂｐ的上方均有条带，表明与理论结果相符。逡逑睡＇邋逦＾逡逑Ｋ逦＂１逡逑＾逦？邋ｉ－ｉ逡逑困２－７邋ｍｅｔＫ连接Ｔ毅体的质粒进行双髓切后的电泳结柴逡逑Ｆｉｇ．邋２－７邋Ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｆｏｒ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｏｆ邋ＳＡＭ邋ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ逡逑ｔｏ邋Ｔ邋ｃａｒｒｉｅｒ逡逑３、将质粒进行n,序，与Ｇｅｎｂａｎｋ发表的序列的结果对比，显示两个序列完全相符。逡逑—？，逡逑＇Ｓ逡逑２．４．邋３重组巧粗ｐＥＴ－２化（＋）邋－ｍｅｔＫ的构建逡逑将ｍｅｔＫ与Ｔ戟体连接的质粒和ｐＥＴ－２化（＋邋）质粒用Ｎｄｅ邋Ｉ酶和Ｈｉｎｄ邋ｍ酶进行逡逑双酶切：双酶切后将所需条带进行切胶间收；将切胶回收的ｍｅｔＫ巧酶切后切胶回收逡逑的ｐＥＴ－２２ｂ邋（邋＋邋）载体相连构建重组表达载体ｐＥＴ－２２ｂ邋（邋＋邋）邋－ｍｅＵＣ。将此重组质粒进行逡逑菌落ＰＣＲ，并将培养的菌液提质粒，并将质粒用Ｎｄｅｌ酶和Ｈｉｎｄ邋ＩＩＩ酶进行双酶切鉴逡逑．逦定。条带大小符合预期的克隆，还需测序进行最终验证。逡逑■逦１、双酶切结果显示，ｐＥＴ－２２ｂ邋（＋）的质粒酶切后的电泳条带在５０００ｂｐ邋Ｗ上。ｍｅｔＫ逡逑与Ｔ载体连接的质粒进行双酶切后的电泳条带在ｌＯＯＯｂｐ和２０００ｂｐ邋上，符合结果，逡逑如图２－８所示。逡逑４２逡逑
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q814

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