草酸青霉木质纤维素降解相关酶类的表征与增效机制研究

发布时间：2020-03-15 00:05

【摘要】：木质纤维素生物质的生物降解研究具有重要的生物学和工业应用意义。对木质纤维素降解酶系进行组成优化和酶学性质改造,对促进木质纤维素生物转化生产生物燃料和大宗化产品具有重要价值。草酸青霉(Penicillium oxalicum)作为一种重要的产纤维素酶工业微生物,和里氏木霉相比具有酶系组成和比例更加合理、半纤维素酶活力更高的优点。目前已有的草酸青霉木质纤维素降解酶系在大规模工业化生产生物乙醇中仍然存在用量大、成本高的问题。找到能够促进纤维素降解的关键酶组分、降低生产成本是提高木质纤维素生物转化经济性的关键途径之。本论文的主要研究结果如下:1.草酸青霉木质纤维素降解酶库的构建及其成员的酶学性质研究通过同源、异源方式表达了 12种木质纤维素降解相关酶,构建成一个小型的草酸青霉木质纤维素降解酶库。其中纤维素酶有2种,半纤维素酶有8种,此外还有2个辅助酶。测定了部分酶库成员的比酶活、最适温度、最适pH、温度稳定性以及pH耐受性。外源添加β-葡萄糖苷酶能够显著提高草酸青霉高产菌株JU-A10-T酶系对工业废渣木糖渣的糖化能力,从而减少了达到同等水解效率时酶的用量。2.添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D等半纤维素酶对预处理木质纤维素底物降解的促进作用添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D和内切-β-1,4-甘露聚糖酶Man5A可以明显促进草酸青霉酶系降解水热法预处理的玉米芯和木糖渣时的葡萄糖产量。进一步探究Abf43D促进纤维素降解的机理发现,用Abf43D预处理能够提高底物的转化率,推测其能够通过除去底物中木聚糖侧链上的阿拉伯呋喃糖基,从而打破糖化中的抗降解屏障,与内切-β-1,4-木聚糖酶Xyn1OA等协同促进半纤维素的降解,并有利于纤维素酶对纤维素的水解,最终提高了葡萄糖产量。此外Abf43D的添加能够缓解木聚糖水解液对纤维二糖水解酶活力的抑制作用。3.添加醛糖酸内酯酶AltA对木质纤维素糖化中β-葡萄糖苷酶活力和葡萄糖产量的影响D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力有强烈的抑制作用。添加AltA能缓解D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力的抑制。向糖化体系中添加AltA,不仅能提高草酸青霉和里氏木霉酶系的β-葡萄糖苷酶活力,还能促进纤维素的降解。通过HPLC-ESI-Q-TOF MS分析,证实了当AltA存在时糖化体系内的D-葡萄糖酸-1,5-内酯水平显著降低。当添加叠氮化钠和金属离子螯合剂EDTA抑制氧化还原酶类活性后,AltA的增效作用明显减小。4.裂解性多糖单加氧酶-醛糖酸内酯酶-β-葡萄糖苷酶(LPMO1-AltA-BGL1)协同体系降解木质纤维素研究及其组分配比的优化证实了 LPMO1-AltA-BGL1体系能够协同降解磷酸膨胀纤维素,并可促进商业纤维素酶降解微晶纤维素和多种预处理的木质纤维素类底物。糖化体系中存在AltA时,内酯含量下降、β-葡萄糖苷酶活力上升,说明AltA缓解了可能由LPMO1产生的内酯对BGL1的抑制,从而使协同体系进一步发挥效果。利用Design Exβert软件设计了混料实验并预测了优化方案,得到LPMO1、AltA和BGL1的最优配比约是3:8:14。
【图文】：

纤维素进一步镶嵌在一个半纤维素、果胶和木素的基质中（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ邋ａｎｄ逡逑Ｂｅｒｍｅｋ２００９），其中木素和半纤维素位于初级和次级细胞壁的微纤维间隙中和中逡逑胶层中（图１－１）。逡逑＾ＯＨ逦＾ＯＨ逦户邋ＯＨ逡逑９邋各。／邋ｖ４。／逡逑ＯＨ逦ＯＨ逦ＯＨ逡逑ｐ－Ｃｏｕｍａｒｙｌ邋ａｌｃｏｈｏｌ邋Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ邋ａｌｃｏｈｏｌ邋Ｓｉｎａｐｙｉ邋ａｌｃｏｈｏｌ逡逑＠邋：栙．卢，、y’逡逑ｆ逦Ｍａｃｒｏｆｉｂｒｉｌ逡逑贷：．Ｖ兴皆逡逑Ｐｅｎｔｏｓｅ逦．逦＇逦—逡逑Ｈｅｘｏｓｅ：＾＾＾逡逑。８＂。＇。５６逡逑Ｃｕ邋打邋ｅｎｔ邋ＯｐＷｏｎ邋ｉｎ邋bq邋０！说邋ｈｎｏｌｏｇｙ逡逑图１－１木质纤维素的多层次结构模型（Ｍｅ巧ａｎｄ民ａｇａｕｓｋａｓ邋２０１４）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｉ＊ｅｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．逡逑与纤维素相比，半纤维素拥有更多样的组成和结构。半纤维素包括木聚糖、逡逑甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖等聚合物（Ｂｅｇｅｔ邋ａｌ．邋２００１）。半纤维素中主要的逡逑聚糖类型如表１－１所示。自然界中含量最丰富的半纤维素是木聚糖，其主链由Ｐ－Ｄ－逡逑２逡逑

图１－２酶解纤维素示意图。ＥＧ断开纤维素链，为ＣＢＨ提供更多可作用的缺口。ＣＢＨ嘛uQＨ逡逑ＩＩ分R%沿着纤维素的还原端和非还原端进行性水解出纤维二糖单元。纤维二糖又被ＢＧ水解逡逑成葡萄糖巧ｅｒｌｉｎ邋２０１３）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏ打邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．邋ＥＧｓ邋ｃｌｅａｖｅ邋化ｅ邋ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ｃｈａｉｎｓ邋化邋ｇｅｎｅｒａｔｅ逡逑ａｐｐｒｏａｃｈａｂｌｅ邋ｅｎｄｓ邋ｆｏｒ邋ＣＢＨｓ－邋ＣＢＨ邋Ｉ邋ａｎｄ邋ＣＢＨ邋ＩＩ邋ｃｌｅａｖｅ邋ｃｅｌ山ｌｏｓｅ邋ｉｎ邋ａ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ邋ｍａｎｎｅｒ，逡逑ｒｅｌｅａｓｉｎｇ邋ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ邋ｆｒｏｍ邋ｒｔｉｅ邋ｉ＊ｅｄｕｃｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎｕｓ邋ｏｆ邋ｌ；ｈｅ邋ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ｃｈａｉｎ，，逡逑ｉ＊ｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．邋Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ邋ｉｓ邋ｔｈｅｎ邋ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ邋ｉｎｌ；ｏ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｂｙ邋目Ｇ．逡逑１．２．２半巧维素巧逡逑目前木质纤维素生物质中半纤维素组分的有效利用尚未达到葡萄糖的水平，逡逑因此在一定程度上削弱了木质纤维素生物转化技术的竞争力（Ｗｙｍａｎ邋１９９９）。将半逡逑纤维素生物转化成可酵解糖是实现生物艺醇商业化生产的重要一步。酶解法是一逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q936

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本文编号：2587073