嗜热内切纤维素酶AcCel12B的酶学性质研究

发布时间：2017-03-22 03:00

  本文关键词：嗜热内切纤维素酶AcCel12B的酶学性质研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：木质纤维素是世界上来源丰富的可再生资源。综合运用物理、化学和生物的方法,将木质纤维素降解为单糖及寡糖,进而用微生物发酵生产大宗化学品,是解决人类严重依赖化石资源的有效途径之一。目前广泛使用的商品纤维素酶主要来源于中温真菌,而高温微生物产生的纤维素酶与之相比,具有显著的优势,因此,高温纤维素酶系的研究受到广泛的关注。根据催化反应过程中对底物的作用方式不同,一般将纤维素酶分为内切纤维素酶,外切纤维素酶或纤维二糖水解酶,和β-葡萄糖苷酶三种类型。纤维素酶降解纤维素是一个协同的酶促反应过程,内切纤维素酶首先进攻纤维素的无定型区域,为纤维二糖水解酶渐进性水解纤维素提供更多的作用位点,纤维二糖水解酶从纤维素的还原端或非还原端切下纤维二糖,最后β-葡萄糖苷酶将纤维寡糖和纤维二糖水解为葡萄糖,从而可以防止产生的纤维二糖对纤维二糖水解酶产生阻遏作用。此外,有些微生物分泌的纤维素酶及相关的酶亚基能够在体外自组装到脚手架蛋白上,形成复杂的纤维小体。另外,糖磷酸化酶、裂解酶、氧化酶等也在木质纤维素的降解中扮演了重要角色。嗜热细菌Acidothermus cellulolyticus 11B可在高温酸性条件下,利用木质纤维素快速生长。基因组分析表明,该菌种产生丰富的纤维素酶,对该菌中纤维素酶的表征及功能分析具有重要的意义和潜在的工业应用价值。来源于A.cellulolyticus 11B中的内切纤维素酶(Ac Cel12B,E.C.3.2.1.4)和纤维二糖水解酶(Ac Cbh48,E.C.3.2.1.91)是典型的模块酶,而β-葡萄糖苷酶(Ac Bgl1,E.C.3.2.1.21)仅有一个催化结构域。Ac Cel12B的功能模块依次为催化模块(属于糖苷水解酶第12家族,GH12)和纤维素结合模块(属于纤维素结合模块第二家族,CBM_2),这两个模块由一个富含脯氨酸/丝氨酸Linker结构域相连接。Ac Cbh48的功能模块依次为纤维素结合结构域(属于纤维素结合模块第三家族,CBM_3a)、催化模块(属于糖苷水解酶第48家族,GH48)、纤维连接蛋白结构域(FN3)和纤维素结合结构域(属于纤维素结合模块第二家族,CBM_2),由三个富含脯氨酸/丝氨酸Linker结构域相连接。模块酶的功能模块之间的协同作用是通过Linker介导的,但是其介导的机制还不清楚。为此,本论文克隆、异源表达了来源于嗜热细菌A.cellulolyticus 11B的内切纤维素酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶;对内切纤维素酶的底物特异性、产物特异性及其协同水解纤维素酶等进行了系统的研究;构建了内切纤维素酶的截短突变体并对其性质进行研究。本论文主要获得如下结果:(1)克隆了嗜热菌株A.cellulolyticus 11B的Ac Cel12B、Ac Cbh48和Ac Bgl1基因,以p ET-20b为表达载体,以E.coli BL 21为宿主菌对这三个基因进行了异源表达,但是Ac Cbh48未能成功表达纯化;(2)对Ac Cel12B和Ac Bgl1的酶学性质进行了表征,结果表明Ac Cel12B以再生无定型纤维素(RAC)为底物时,其最适温度为72oC,最适p H为4.3,在70oC下孵育2h仍残余50%以上的酶活性,此酶在高温下水解纤维素底物表现出了很高的酶活力。Ac Bgl1以p NPGlc为底物时,最适温度为70oC,最适p H为7.0,可渐进性水解纤维寡糖生成葡萄糖。(3)Ac Cel12B与Ac Bgl1的分子间协同作用的初步研究,结果表明:Ac Cel12B水解RAC的主要产物为纤维二糖和纤维三糖,Ac Bgl1以纤维二糖和纤维三糖为底物生成葡萄糖,二者在水解不溶性底物RAC时表现出良好的正协同性,反应2 h时Ac Cel12B和Ac Bgl1的最佳摩尔比为1:4;(4)设计了Linker截短突变体(Ac Cel12B△PS)对Linker的功能进行研究,经酶学性质分析表明,Ac Cel12B△PS与Ac Cel12B一样表现出很好的热稳定性和较高的酶活力。而内切纤维素酶Linker区域的变化,尤其是PS刚性结构的去除会使Linker区域柔性的发生改变,导致酶对水解不溶性底物的比活和水解率均有所降低,酶的热稳定性也受到影响,但增强了蛋白在中性条件下的p H稳定性。综上所述,本课题对源于A.cellulolyticus 11B中的嗜热纤维素酶学性质、协同作用及Linker突变体的功能研究,有助于进一步深入理解纤维素酶结构域的功能和催化机理,为进一步的理论研究提供了依据。
【关键词】：嗜热微生物 纤维素酶 截短突变体 Acidothermus cellulolyticus 11B 水解时间进程 协同作用
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 第1章 前言15-33
• 1.1 纤维素与生物质能源15-16
• 1.1.1 纤维素结构15-16
• 1.1.2 纤维素生物燃料转化16
• 1.2 纤维素酶16-21
• 1.2.1 纤维素酶分类和分子结构17-18
• 1.2.2 纤维素酶催化机理18-20
• 1.2.3 纤维素酶应用20-21
• 1.3 嗜热微生物源纤维素酶21-24
• 1.4 立题依据和实验设计24-26
• 1.5 参考文献26-33
• 第2章 内切纤维素酶Ac Cel12B的性质研究33-71
• 2.1 引言33-34
• 2.2 实验材料34-39
• 2.2.1 菌株与质粒34-35
• 2.2.2 培养基35-36
• 2.2.3 试剂36-37
• 2.2.4 溶液配制37-38
• 2.2.5 主要仪器38-39
• 2.3 实验方法39-47
• 2.3.1 内切纤维素酶Ac Cel12B的序列分析39
• 2.3.2 内切纤维素酶Ac Cel12B基因的克隆、构建与表达39-42
• 2.3.3 重组内切纤维素酶Ac Cel12B的纯化42-43
• 2.3.4 蛋白浓度的测定43
• 2.3.5 内切纤维素酶Ac Cel12B酶活力的测定43
• 2.3.6 最适p H、最适温度以及热稳定性测定43-44
• 2.3.7 金属离子及化学试剂对酶活力的影响44
• 2.3.8 酶底物特异性测定44-45
• 2.3.9 内切纤维素酶Ac Cel12B动力学常数测定45
• 2.3.10 HPLC法测定产物谱45
• 2.3.11 酶对寡糖水解能力的测定45-46
• 2.3.12 不溶性底物水解进程的测定46
• 2.3.13 Ac Cel12B对Avicel吸附性测定46
• 2.3.14 热力学稳定性分析46
• 2.3.15 分子建模与底物对接46-47
• 2.4 结果与分析47-63
• 2.4.1 内切纤维素酶Ac Cel12B的序列分析47-49
• 2.4.2 内切纤维素酶Ac Cel12B基因的克隆与构建49-50
• 2.4.3 内切纤维素酶Ac Cel12B的表达和纯化50-51
• 2.4.4 最适p H、最适温度以及热稳定性测定51-54
• 2.4.5 金属离子及化学试剂对酶活力的影响54
• 2.4.6 酶底物特异性测定54-55
• 2.4.7 酶动力学常数测定55-56
• 2.4.8 HPLC法测定产物谱56-57
• 2.4.9 酶对寡糖水解能力的测定57-58
• 2.4.10 不溶性底物水解进程的测定58-60
• 2.4.11 Ac Cel12B对Avicel吸附性测定60
• 2.4.12 热力学稳定性分析60-61
• 2.4.13 分子建模与底物对接61-63
• 2.5 小结63-65
• 2.6 参考文献65-71
• 第3章 Ac Cel12B纤维素酶协同作用的研究71-91
• 3.1 引言71-72
• 3.2 实验材料72-73
• 3.2.1 菌株与质粒72
• 3.2.2 培养基72-73
• 3.2.3 试剂73
• 3.2.4 溶液配制73
• 3.2.5 主要仪器73
• 3.3 实验方法73-75
• 3.3.1 纤维素酶基因的克隆、构建与表达73-74
• 3.3.2 重组纤维素酶的纯化74
• 3.3.3 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1的性质表征74
• 3.3.4 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1底物特异性测定74-75
• 3.3.5 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1对寡糖水解能力的测定75
• 3.3.6 纤维素酶协同性测定75
• 3.4 结果与分析75-87
• 3.4.1 纤维素酶的序列分析75-81
• 3.4.2 纤维素酶基因的克隆、构建与表达81-82
• 3.4.3 纤维素酶的表达和纯化82-83
• 3.4.4 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1的性质表征83-84
• 3.4.5 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1底物特异性测定84
• 3.4.6 β-葡萄糖苷酶Ac Bgl1对寡糖水解能力的测定84-86
• 3.4.7 纤维素酶协同性测定86-87
• 3.5 小结87-88
• 3.6 参考文献88-91
• 第4章 Ac Cel12B中Linker作用的研究91-111
• 4.1 引言91-92
• 4.2 实验材料92-93
• 4.2.1 菌株与质粒92
• 4.2.2 培养基92-93
• 4.2.3 试剂93
• 4.2.4 溶液配制93
• 4.2.5 主要仪器93
• 4.3 实验方法93-97
• 4.3.1 序列分析93
• 4.3.2 突变体基因的克隆、构建与表达93-95
• 4.3.3 突变体重组蛋白的纯化95
• 4.3.4 蛋白浓度的测定95
• 4.3.5 突变体酶活力的测定95
• 4.3.6 最适p H、最适温度以及热稳定性测定95-96
• 4.3.7 突变体酶动力学常数测定96
• 4.3.8 HPLC法测定产物谱96
• 4.3.9 不溶性底物水解进程的测定96
• 4.3.10 热力学稳定性分析96-97
• 4.4 结果与分析97-106
• 4.4.1 序列分析97-99
• 4.4.2 突变体基因的克隆、构建与表达99-100
• 4.4.3 突变体蛋白的表达和纯化100-101
• 4.4.4 最适p H、最适温度以及热稳定性测定101-104
• 4.4.5 酶动力学常数测定104
• 4.4.6 HPLC法测定产物谱104-105
• 4.4.7 不溶性底物水解进程的测定105-106
• 4.4.8 热力学稳定性分析106
• 4.5 小结106-108
• 4.6 参考文献108-111
• 创新点111-113
• 展望113-115
• 攻读博士期间成果115-117
• 致谢117

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