金黄色葡萄球菌烯醇酶Enolase的结构和功能研究
本文关键词：金黄色葡萄球菌烯醇酶Enolase的结构和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：烯醇酶(Enolase)是在所有真核和原核生物细胞质中都存在的一种进化上高度保守的极其重要的糖代谢金属酶,主要催化2-磷酸甘油酸(2-PG)脱水形成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。在合适的条件下,也可以催化该反应的可逆反应。Enolase可以定位在一系列细胞的表面,包括癌症细胞、造血细胞、神经元细胞和感染性致病菌。细胞表面的enolase可以作为纤维蛋白溶酶原(plasminogen)的受体,通过激活纤维蛋白溶酶(plasmin)增强细胞纤溶活性,导致细胞外基质的降解。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种致病性很强的典型革兰氏阳性菌,在全世界范围内频繁地引起大规模的严重感染致病。此外,enolase还是金黄色葡萄球菌RNA降解体中的一员。在第一部分中,我们分别解析了金黄色葡萄球菌enolase分辨率为2.45 A的apo结构和分辨率为1.6 A的PEP结合的复合物结构。晶体结构中enolase以八聚体形式存在,但在溶液状态下enolase同时存在八聚体和二聚体两种状态。此外,野生型和突变体enolase酶活实验显示只有八聚体具有催化活性,二聚体失去催化能力。等温滴定量热(ITC)实验显示二聚体不能结合底物,而八聚体能够结合底物。RhlB (RNA解旋酶B)是大肠杆菌5个DEAD-box解旋酶中的一个,它的活性依赖于ATPase水解ATP以提供能量。RhlB的ATPase活性和RNA解旋能力需要RNaseE参与协调。果蝇的DEAD-box解旋酶Vasa与单链RNA和AMP-PNP (ATP类似物)的复合物结构为揭示RNA duplex解聚的机理提供了线索,但是RNaseE和ATPase在这个过程当中的作用还不是很清楚。在第二部分中,我们克隆,表达并纯化了大肠杆菌RhlB的全长蛋白和不同片段截短体蛋白,并进行了晶体初次筛选,后续实验中尝试加入ssRNA和AMP-PNP与目的蛋白共同结晶,但都没有使得目的蛋白成功结晶。在此基础上,我们进一步设计纯化出了RhlB/RNaseE和RhlB/RNaseE/RraA两种蛋白复合物,并用于结晶筛选。在RhlB/RNaseE/RraA复合物晶体生长过程中,只有RraA单个分子出现在晶体中,RhlB和RNaseE并没有出现在结构中。我们还尝试了酶解实验和交联实验。这些实验结果为将来对RhlB和RNaseE研究提供了一些线索。
【关键词】：纤维蛋白溶酶原 金黄色葡萄球菌 Enolase 二聚体 八聚体 大肠杆菌 RNA解旋酶B
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：
- 摘要5-6
- Abstract6-10
- 第一部分 金黄色葡萄球菌烯醇酶enolase的结构和功能研究10-96
- 第一章 绪论10-30
- 1.1 金黄色葡萄球菌10-19
- 1.1.1 金黄色葡萄球菌耐药性10-12
- 1.1.2 金黄色葡萄球菌致病因子12-15
- 1.1.3 金黄色葡萄球菌的疫苗15-19
- 1.2 Enolase背景介绍19-29
- 1.2.1 简介19-20
- 1.2.2 Enolase结构特点20-21
- 1.2.3 Enolase催化机理21-22
- 1.2.4 Enolase生理功能22-29
- 1.3 选题意义及研究内容29-30
- 第二章 实验材料与方法30-42
- 2.1 表达质粒的构建30-35
- 2.2 蛋白质的表达与纯化35-38
- 2.3 蛋白质晶体的生长和优化38-39
- 2.4 数据收集和结构解析39
- 2.5 Sa_enolase酶活实验39-40
- 2.6 SPR实验40
- 2.7 ITC实验40-41
- 2.8 Native-PAGE41
- 2.9 EPR实验41-42
- 第三章 实验结果与讨论42-84
- 3.1 引言42-43
- 3.2 原核表达43-44
- 3.3 Sa_enolase融合蛋白的纯化和结晶44-49
- 3.4 Sa_enolase晶体结构模型的质量评估49-59
- 3.5 Sa_enolase的整体结构59-64
- 3.6 Sa_enolase中PEP和Mg~(2+)的结合位点64-69
- 3.7 Sa_enolase八聚体的组装69-73
- 3.8 Sa_enolase的酶活检测73-78
- 3.9 Sa_enolase与其他蛋白的相互作用78-82
- 3.9.1 Sa_enolase与Laminin的结合实验78-80
- 3.9.2 Sa_enolase与CshA的相互作用80-81
- 3.9.3 Sa_enolase与Plasminogen的相互作用81-82
- 3.10 总结与展望82-84
- 参考文献84-96
- 第二部分 大肠杆菌RNA解旋酶RhlB的结构生物学研究96-134
- 第四章 绪论96-106
- 4.1 大肠杆菌RNA降解体96-101
- 4.2 大肠杆菌RhlB101-104
- 4.3 大肠杆菌RraA104-105
- 4.4 选题意义及研究内容105-106
- 第五章 实验材料与方法106-108
- 5.1 原核表达载体构建106-107
- 5.2 纯化与晶体筛选107-108
- 第六章 实验结果与讨论108-128
- 6.1 引言108-109
- 6.2 原核表达109-110
- 6.3 大肠杆菌RhIB及相关蛋白的纯化110-127
- 6.4 总结与展望127-128
- 参考文献128-134
- 致谢134-135
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 朱风兰,王海涛,田长星,过祥豹,汪美先;金黄色葡萄球菌A蛋白的提取及其影响因素的初步探讨[J];第四军医大学学报;1983年02期
2 秘学文;来则民;郭素贤;刘景英;;金黄色葡萄球菌A蛋白的制备和鉴定[J];天津医药;1983年06期
3 何敏,白京荣;一株L型金黄色葡萄球菌的返祖与鉴定[J];苏州医学院学报;1997年03期
4 韩景田,李浴峰,叶路,宋月英,买霞;驱蚊露诱导金黄色葡萄球菌L型形成的实验观察[J];现代中西医结合杂志;2000年19期
5 李向阳,于静涛,丁吉宗;温度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌代谢过程的规律研究[J];中国卫生检验杂志;2001年05期
6 邢建明,周丰宁,张u&;实时荧光定量聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌[J];中华医院感染学杂志;2005年08期
7 周勤华;;金黄色葡萄球菌A蛋白基因的克隆、表达和纯化[J];嘉兴学院学报;2007年03期
8 范一灵;潘峰;史贤明;;金黄色葡萄球菌分子检测技术的常用靶基因[J];微生物学杂志;2008年03期
9 胡娜;肖夏;杜斌斌;熊亚利;徐玲;;金黄色葡萄球菌蛋白A基因的克隆[J];安徽农业科学;2009年25期
10 ;理性科学对待金黄色葡萄球菌[J];生命世界;2012年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 单璐;童宇峰;冯银钢;王金凤;;金黄色葡萄球菌核酸酶无脯氨酸突变体的溶液结构及骨架动态特性研究[A];第十三届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2004年
2 王良兴;;金黄色葡萄球菌致病性研究现状及进展[A];2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
3 唐吉思;吴金花;布日额;张海宝;薛晓阳;刘洋;;内蒙古牛乳中产肠毒素A型金黄色葡萄球菌的分离与鉴定[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年
4 梁景涛;谢翊;林秋芬;卢振林;陈淑玲;;三种食品中金黄色葡萄球菌检测方法的比较研究[A];2010广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2010年
5 索玉娟;于宏伟;凌巍;贾英民;;食品中金黄色葡萄球菌污染状况研究[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
6 杨玉书;;135株金黄色葡萄球菌耐药率分析[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年
7 邵东华;邱亚峰;沈阳;史子学;马志永;;金黄色葡萄球菌快速检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
8 王敏;单璐;王金凤;;金黄色葡萄球菌核酸酶C-端缺失片段溶液构象的多维核磁共振研究[A];中国科协2005年学术年会生物物理与重大疾病分会论文摘要集[C];2005年
9 蒋荩芳;;金黄色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析[A];第二十二届航天医学年会暨第五届航天护理年会论文汇编（下册）[C];2006年
10 朱战波;任宪刚;崔玉东;朴范泽;;金黄色葡萄球菌的分子生物学分型研究进展[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（下册）[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 王小龙;夏秋两季易感染金黄色葡萄球菌[N];科技日报;2011年
2 国家二级营养师 李纯;警惕牛奶中的金黄色葡萄球菌[N];健康报;2012年
3 本报记者 闫巍;《速冻》新国标将实施专家称已与世界接轨[N];粮油市场报;2011年
4 记者 桂运安;金黄色葡萄球菌入侵细胞新机制[N];安徽日报;2014年
5 记者 马晓华;水饺新国标再起争议 卫生部称不影响食品安全[N];第一财经日报;2011年
6 记者 白毅;金黄色葡萄球菌感染宿主“帮凶”被找到[N];中国医药报;2014年
7 侯震;金黄色葡萄球菌致中毒[N];大众卫生报;2000年
8 北京大学临床药理研究所 卫生部全国细菌耐药监测网 王进;金黄色葡萄球菌在蔓延[N];健康报;2008年
9 本报记者 徐建华;“限量检出”更符合实际[N];中国质量报;2011年
10 本报记者 郭朝飞;应对“细菌门”思念、三全业绩表现迥异[N];中国经济时报;2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杜昕;新的细胞壁锚定蛋白SasX在金黄色葡萄球菌定植和感染中的作用及其作为疫苗靶点可行性的初步研究[D];复旦大学;2014年
2 陈川;金黄色葡萄球菌gdpS调控毒性因子spa的机制研究[D];中国科学技术大学;2015年
3 尼玛青格乐;mTORC1在金黄色葡萄球菌及其肽聚糖诱导炎性反应中的作用与机制[D];内蒙古大学;2015年
4 吴青;建立金黄色葡萄球菌快速检测方法及耐药机制的研究[D];武汉大学;2013年
5 李长伟;白细胞介素33在机体抵御金黄色葡萄球菌感染中的功能机制[D];华东师范大学;2015年
6 宋军;金黄色葡萄球菌噬菌体GH15穿孔素功能研究[D];吉林大学;2016年
7 胡园园;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的核酸检测方法研究[D];中国科学院研究生院(武汉病毒研究所);2016年
8 王亮亮;乳酸菌预防金黄色葡萄球菌乳腺炎的机制研究[D];西北农林科技大学;2016年
9 伍云飞;金黄色葡萄球菌烯醇酶Enolase的结构和功能研究[D];中国科学技术大学;2015年
10 王小红;金黄色葡萄球菌B型肠毒素的溶液构象及菌体生长环境效应[D];华中农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈洁;硬蜱卵蜡层抑菌分子研究[D];河北师范大学;2015年
2 李霞;左旋咪唑增强金黄色葡萄球菌凝集因子A亚单位疫苗免疫效果的研究[D];内蒙古大学;2015年
3 陈文玲;适配体化磁纳米富集及生物发光检测金葡菌[D];江南大学;2015年
4 刘有福;四种常见化脓性感染病原菌的分子检测[D];昆明理工大学;2015年
5 林作鹏;贝壳煅烧物抗菌性研究[D];大连海洋大学;2014年
6 苏怡;上海市医院金黄色葡萄球菌抗生素耐药及消毒剂抗性研究[D];复旦大学;2013年
7 闫虹;耐f裱跷髁纸鸹粕咸亚蚓鸵┬约捌浞中脱芯縖D];郑州大学;2015年
8 刘静;金黄色葡萄球菌分子特征及耐药相关分子标志[D];郑州大学;2015年
9 陈洪升;金黄色葡萄球菌氨基糖苷类、喹诺酮耐药基因的研究[D];广东药学院;2015年
10 姚蕾;亚抑菌浓度β内酰胺类药物对金黄色葡萄球菌α溶血素的表达调控作用[D];安徽医科大学;2015年
本文关键词：金黄色葡萄球菌烯醇酶Enolase的结构和功能研究，由笔耕文化传播整理发布。
，本文编号：261837
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/jckxbs/261837.html
