水稻苗期耐高温基因OsHTAS的功能研究

发布时间：2017-03-23 02:17

  本文关键词：水稻苗期耐高温基因OsHTAS的功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着全球气候变暖,高温胁迫严重影响农作物的产量和质量,制约着全球的农业生产。泛素蛋白酶体途径是植物体内翻译后修饰最重要的调控机制之一,研究表明泛素蛋白酶体途径也参与对生物胁迫和非生物胁迫的调控。逆境胁迫下产生的活性氧(ROS)具有双重作用,当活性氧的积累处于较低水平时,可以作为逆境信号触发植物体的胁迫防御反应,引起气孔关闭：当活性氧的水平超过植物体自身承受能力时,就会对植物体造成伤害,导致其死亡。OsHTAS编码一个RING型泛素连接酶,应用现有的分子生物学手段与方法,对它的功能开展了研究,其主要结果与结论如下：(1) OsHTAS在水稻苗期的根部、地上部,生殖生长期的剑叶片、茎秆、剑叶鞘和穗中都有表达,其中,剑叶片中的表达水平最高,属于组成型表达。另外,高温、高盐、低温、过氧化氢以及脱落酸都能诱导OsHTAS的表达,对其表达诱导能力最强的是脱落酸。(2)生物信息学预测显示OsHTAS蛋白的N端包含4个跨膜结构域,C端包含一个RING (Really Interesting New Gene) finger结构域。(3) OsHTAS的RNA干扰转基因株系在苗期表现出高温敏感表型,相反,OsHTAS过表达的转基因株系以及功能获得性突变体oshtas则在苗期表现出对高温的抗性。(4)烟草叶片表皮和水稻原生质体瞬时表达OsHTAS,发现它编码的蛋白在细胞核和细胞质中均有分布。(5)酵母双杂交显示：无论是OsHTAS的N端、RING finger结构域,还是全长蛋白都不具有自激活活性。用OsHTAS的RING finger结构域筛库时发现四个与之互作基因,分别编码两个泛素结合酶(E2)蛋白、一个泛素延伸蛋白($27a)和一个核糖体蛋白(40SRPS)；用N端筛库时,发现两个与之互作的基因,其中,一个编码抗坏血酸过氧化物酶(APX8),另一个编码生长素输出载体组件。(6)水稻原生质体转化表明OsHTAS蛋白与S27a蛋白在细胞核中共定位。对RING finger结构域的保守氨基酸进行点突变发现RING finger与两个泛素结合酶(E2)之间的互作消失,证明OsHTAS通过RING finger结构域与E2互作。(7) OsHTAS抑制表达株系中逆境相关基因以及与之互作的基因全部下调表达：相反在过表达株系以及突变体oshtas中这些基因的表达基本全部上调,其中上调最明显的是编码ABA合成限速酶的基因NCED4。(8)突变体oshtas中抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶的活性在高温处理后低于野生型,与此相应,oshtas中的过氧化氢含量在高温处理后则高于野生型。(9)突变体oshtas中的ABA含量显著高于野生型中花11；与此对应的是,oshtas中完全关闭气孔比例在高温胁迫处理后明显高于野生型,尽管这两个材料中的气孔关闭状态在高温胁迫处理前没有明显差异,另外,高温胁迫处理后oshtas中完全张开的气孔比例则明显低于野生型。(10)对OsHTAS RNA干扰株系的农艺性状考查显示该基因在正常大田生长条件下对水稻的主要农艺性状有一定影响。与野生型相比,OsHTAS RNA干扰株系的分蘖数、每穗粒数和二次枝梗数减少,株高降低,一次枝梗数增加,但结实率在二者之间没有差异。以上结果表明OsHTAS是水稻抵抗高温胁迫过程中的正调控因子,它通过提高逆境相关基因的的表达,增加植物体内ABA和过氧化氢含量,诱导气孔关闭等分子途径提高水稻苗期的高温抗性。
【关键词】：耐高温 OsHTAS 脱落酸 过氧化氢 气孔
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S511;Q943.2
【目录】：

• 致谢6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-19
• 缩略词表19-21
• 1 前言21-47
• 1.1 植物与逆境胁迫21-24
• 1.1.1 植物体内非生物胁迫的信号转导21-23
• 1.1.2 非生物胁迫的多层次调控模式23-24
• 1.2 泛素/26s蛋白酶体系统24-34
• 1.2.1 泛素及泛素化过程的基本概念24-25
• 1.2.2 泛素化过程中的关键酶25-27
• 1.2.3 泛素化修饰的几种方式27-28
• 1.2.4 泛素蛋白酶体在植物体内的作用28-31
• 1.2.5 泛素蛋白酶体途径在逆境胁迫中的作用机制(以干旱胁迫为例)31-34
• 1.2.5.1 单Ub分子对植物干旱胁迫的调控研究31
• 1.2.5.2 E2蛋白对植物干旱胁迫的调控研究31-32
• 1.2.5.3 E3蛋白对植物干旱胁迫的调控研究32-34
• 1.3 植物抗高温的主要机制34-40
• 1.3.1 抗氧化物质在高温胁迫中的作用35-39
• 1.3.2 热激转录因子和热激蛋白在高温胁迫中的作用39
• 1.3.3 转录因子在高温胁迫中的作用39-40
• 1.4 ROS的双重作用40-45
• 1.4.1 ROS作为信号分子40-43
• 1.4.2 ROS参与气孔运动43-45
• 1.5 本研究的目的与意义45-47
• 2 材料与方法47-67
• 2.1 实验材料47-48
• 2.1.1 植物材料47
• 2.1.2 菌株和载体47
• 2.1.3 主要试剂及酶47-48
• 2.2 实验方法48-67
• 2.2.1 DNA提取及PCR鉴定48
• 2.2.2 RNA的抽提和反转录48-49
• 2.2.3 PCR、RT-PCR和Real=time PCR的检测49
• 2.2.4 各种载体的构建49-53
• 2.2.5 水稻的遗传转化(农杆菌介导法)53-55
• 2.2.6 逆境胁迫处理及取样55-56
• 2.2.7 OsHTAS以及互作蛋白的亚细胞定位56-59
• 2.2.8 酵母双杂交筛选互作蛋白59-61
• 2.2.8.1 酵母双杂交筛库59-60
• 2.2.8.2 酵母质粒提取60-61
• 2.2.8.3 酵母双杂交的点对点验证61
• 2.2.9 蛋白质的原核表达、纯化及Western blot61-63
• 2.2.9.1 蛋白质的原核表达和纯化61-62
• 2.2.9.2 Western blot62-63
• 2.2.10 抗氧化物酶活性及过氧化氢含量测定63-64
• 2.2.11 扫描电镜样品制各办法64-65
• 2.2.12 ABA含量测定65
• 2.2.13 水稻苗期高温处理表型鉴定65-67
• 3 结果与分析67-100
• 3.1 OsHTAS的表达模式分析67-69
• 3.2 OsHTAS的结构特点69
• 3.3 OsHTAS过量表达及干扰转基因植株的获得及鉴定69-72
• 3.4 OsHTAS功能获得性突变体的鉴定72-74
• 3.5 OsHTAS RNA干扰株系苗期高温处理74-77
• 3.6 oshtas突变体苗期高温处理77
• 3.7 过量表达OsHTAS提高水稻苗期高温抗性77-78
• 3.8 OsHTAS的亚细胞定位分析78-79
• 3.9 OsHTAS的酵母双杂交分析79-86
• 3.9.1 自激活检测80-81
• 3.9.2 酵母双杂交初步筛库81-82
• 3.9.3 RING finger domain与S27a存在相互作用82-83
• 3.9.4 RING finger domain与其它蛋白存在相互作用83-85
• 3.9.5 OsHTASN与APX8存在相互作用85-86
• 3.10 OsHTAS与S27a在水稻原生质体中的共定位分析86-88
• 3.11 OsHTAS RNA干扰株系中逆境相关基因以及互作基因全部下调表达88-89
• 3.12 oshtas中逆境相关基因及互作基因全部上调表达89-90
• 3.13 OsHTAS过表达引起逆境相关基因及互作基因全部上调表达90-91
• 3.14 高温处理后oshtas中抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)活性低于ZH1191-92
• 3.15 高温处理后oshtas中过氧化氢含量高于ZH1192
• 3.16 OsHTAS调控气孔关闭92-94
• 3.17 OsHTAS上调表达增加水稻体内ABA含量94-95
• 3.18 OsHTAS抑制DST基因的表达95-96
• 3.19 OsHTAS以及S27a蛋白的原核表达及Western杂交96-98
• 3.20 OsHTAS RNA干扰株系的农艺性状调查98-100
• 4 讨论100-104
• 4.1 OsHTAS的亚细胞定位100-101
• 4.2 OsHTAS调控气孔运动101-102
• 4.3 OsHTAS的酵母双杂交分析102-104
• 5 全文总计及展望104-106
• 5.1 全文总结104-105
• 5.2 展望105-106
• 参考文献106-127
• 附录127-135
• 附表 (引物)135-138
• 作者简历138
• 博士在读期间发表论文138

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1 刘建平;水稻苗期耐高温基因OsHTAS的功能研究[D];浙江大学;2015年

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本文编号：262716