益生乳酸菌的筛选及其在食品加工上的应用研究

发布时间：2017-03-23 07:08

  本文关键词：益生乳酸菌的筛选及其在食品加工上的应用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乳酸菌及其发酵产品对机体具有诸多益生作用,如调节肠道菌群、提高免疫力、提高抗氧化功能、降低胆固醇、预防各种疾病等;所产乳酸菌素因高效、无毒、耐高温、无残留、无抗药性等优点在食品贮存、发酵、畜牧、化妆品等领域获得越来越广的应用。本研究从传统发酵食品中分离乳酸菌,通过产乳酸菌素验证、体外酸耐受性实验、胆盐耐受性实验、HT-29细胞黏附性实验、产β-葡萄糖苷酶验证等指标筛选出具有益生功能的乳酸菌菌株,对其进行鉴定,并对其益生功能及在食品加工上的应用进行了研究,主要研究结果如下:(1)益生乳酸菌的筛选鉴定通过牛津杯法,从300株分离纯化自发酵食品的乳酸菌中,获得10株可产乳酸菌素的菌株,按抑菌效果大小排列分别为MPE、MP166、MP30、MP85、MP159、MP149、LP4、MPN5、MP170、MPC;耐酸性实验表明,这10株菌均能在pH 3.0条件下存活,且其中MP30、MP85、MP166、MPC、MPN5、MP149、MP170等7株可在此pH条件下生长;胆盐耐受实验表明,LP4、MP30、MP166、MPN5、MP149、MP159、MP170等7株菌株可在胆盐中保持50%以上的存活率;细胞黏附实验表明,菌株MP166对HT-29的黏附性最高,可超过100个细菌/细胞,其次为LP4和MP30,分别为36个细菌/细胞和12个细菌/细胞,其余菌株黏附性则较差,都低于5个细菌/细胞;这10株菌均能产生β-葡萄糖苷酶,其中菌株MP166、LP4和MPC在发酵豆乳中产游离型大豆异黄酮能力较强。综合以上结果,选择MP166为目标菌株进行下一步研究。通过形态学、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析等方法鉴定菌株MP166为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),其16S rRNA基因序列在GenBank中的注册号为KJ610831。(2)MP166菌株益生功能的研究小鼠灌服实验表明,MP166活菌体能使小鼠肠道中乳酸杆菌和双歧杆菌明显增加,大肠杆菌和肠球菌显著减少(P0.05或P0.01);热灭活菌体也能显著降低大肠杆菌和肠球菌的数量;MP166中剂量组(P0.05)和高剂量组(P0.01)小鼠脾脏指数和胸腺指数都显著提高,且小鼠肠黏膜SIgA含量极显著增加(P0.01);MP166菌体和细胞裂解液在体外对DPPH·自由基和羟自由基都有良好的清除能力;在体内MP166中剂量组和高剂量组可以有效提高小鼠血液中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性并降低丙二醛(MDA)的含量(P0.05或P0.01);且MP166使用安全。以上结果表明,MP166具有良好的益生功能。(3)MP166乳酸菌素的纯化及其理化性质研究通过对MP166产乳酸菌素的培养基及培养条件进行优化发现,其产乳酸菌素的最适培养基为MRS培养基,最佳发酵条件为发酵液初始pH 6.5、1%的接种量、36?C发酵24h。经硫酸铵盐析、凝胶层析、阳离子交换层析、SDS-PAGE、ESI-Q-TOF等方法对产物进行分离纯化和检测,获得的乳酸菌素具有较强的热稳定性,120?C处理20min仍保持活力,并且对强酸强碱(pH 2-10)、紫外线(UV)、表面活性剂(Tween 20、Tween80)和高盐(NaCl)等环境因子也具有较强的承受力;抑菌方式测定表明,其抑菌作用方式为非Lantibiotic型。(4)MP166乳酸菌素在食品贮存中的应用研究将纯化的乳酸菌素应用于食品贮存,发现其在4?C和20?C条件下可将原料乳保质期延长1-3倍,对于消毒乳,其在20?C、4?C下保质期可分别延长5倍和超过10倍;在4?C条件下可将猪肉保质期延长3-4倍;并且能明显抑制单核细胞增生李斯特氏菌在牛乳及猪肉中的繁殖。(5)MP166在发酵豆乳上的应用研究通过单因素实验和响应面优化实验,研究了MP166菌株对发酵豆乳中游离大豆异黄酮含量的影响,获得最佳发酵条件为:发酵温度42.59?C、初始pH7.47、接种量5.01%,在此条件下,发酵豆乳中游离大豆异黄酮的含量可达69.06μg/mL,是未发酵豆乳中游离大豆异黄酮的6.14倍。测定豆乳在发酵期间的酸度曲线、蛋白水解能力、活菌数、脱水收缩性等指标表明,L.plantarum MP166在豆乳中生长良好,发酵结束时活菌数可达到4.5×108 CFU/m L,且豆乳蛋白水解性和持水力都显著增加。
【关键词】：益生乳酸菌 小鼠实验 乳酸菌素 食品贮存 游离型大豆异黄酮
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.3
【目录】：

• 中文摘要13-15
• Abstract15-18
• 1 前言18-31
• 1.1 益生菌18
• 1.1.1 益生菌的概念18
• 1.1.2 益生菌的主要种类18
• 1.2 益生乳酸菌18-22
• 1.2.1 乳酸菌的定义18-19
• 1.2.2 乳酸菌的种类19
• 1.2.3 益生乳酸菌的生理功能19-22
• 1.3 乳酸菌的应用22-24
• 1.3.1 食品储存22-23
• 1.3.2 发酵工业23
• 1.3.3 医药工业23
• 1.3.4 畜禽生产与饲料工业23-24
• 1.3.5 其他工业24
• 1.4 细菌素24-28
• 1.4.1 细菌素的定义24
• 1.4.2 细菌素的分类及作用方式24-26
• 1.4.3 细菌素的分离纯化26-27
• 1.4.4 细菌素的应用27-28
• 1.4.5 细菌素研究中存在的问题28
• 1.5 发酵豆乳28-30
• 1.5.1 发酵豆乳的营养价值28-29
• 1.5.2 大豆异黄酮29
• 1.5.3 乳酸菌发酵豆乳中大豆异黄酮形式的转化29-30
• 1.6 本研究的目的及其意义30-31
• 2 材料与方法31-61
• 2.1 材料31-34
• 2.1.1 实验菌株31
• 2.1.2 指示菌31
• 2.1.3 实验动物31
• 2.1.4 培养基的配制31-32
• 2.1.5 主要仪器设备及试剂32-34
• 2.1.5.1 主要仪器设备32-33
• 2.1.5.2 主要试剂33-34
• 2.2 方法34-61
• 2.2.1 益生乳酸菌的筛选34-37
• 2.2.1.1 乳酸菌的分离纯化34
• 2.2.1.2 产细菌素乳酸菌的筛选34-35
• 2.2.1.3 酸耐受性实验35
• 2.2.1.4 胆盐耐受性试35
• 2.2.1.5 对人结肠腺癌细胞HT-29的黏附实验35-36
• 2.2.1.6 高产大豆异黄酮糖苷转化酶菌株的筛选36-37
• 2.2.2 益生乳酸菌的鉴定37-41
• 2.2.2.1 乳酸菌的形态学鉴定和生理生化鉴定37
• 2.2.2.2 乳酸菌总DNA的提取37-38
• 2.2.2.3 16S rRNA序列扩增38
• 2.2.2.4 大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞的制备38-39
• 2.2.2.5 PCR产物的连接39
• 2.2.2.6 重组载体的转化39-40
• 2.2.2.7 菌落PCR40
• 2.2.2.8 质粒提取40
• 2.2.2.9 DNA序列结果比对40-41
• 2.2.3 植物乳杆菌MP166小鼠肠道菌群、抗氧化能力及SIgA的影响研究41-47
• 2.2.3.1 菌液的准备41
• 2.2.3.2 小鼠分组及饲喂方式41
• 2.2.3.3 样品采集与处理41-42
• 2.2.3.4 肠道细菌的培养42
• 2.2.3.5 小鼠肠道内SIgA含量的测定42-43
• 2.2.3.6 免疫器官指数（Immune organs index, IOI）的测定43
• 2.2.3.7 小鼠体内抗氧化指标测定43-46
• 2.2.3.8 植物乳杆菌MP166的体外抗氧化能力测定46-47
• 2.2.3.9 MP166安全性评价47
• 2.2.4 植物乳杆菌MP166生长特性实验47-48
• 2.2.4.1 植物乳杆菌MP166生长曲线的测定47-48
• 2.2.4.2 植物乳杆菌MP166产酸能力的测定48
• 2.2.4.3 植物乳杆菌MP166产抗菌物质趋势的测定48
• 2.2.5 植物乳杆菌MP166产抗菌物质的培养基优化48-49
• 2.2.5.1 基础发酵培养基的筛选48
• 2.2.5.2 不同碳源对抗菌活性组分产量的影响48
• 2.2.5.3 不同氮源对抗菌活性组分产量的影响48
• 2.2.5.4 生长因子对抗菌活性组分产量的影响48
• 2.2.5.5 刺激因子对抗菌活性组分产量的影响48-49
• 2.2.6 植物乳杆菌MP166产抗菌物质的培养条件优化49
• 2.2.6.1 不同接种量对发酵液抑菌活性的影响49
• 2.2.6.2 不同培养温度对发酵液抑菌活性的影响49
• 2.2.6.3 不同装液量对发酵液抑菌活性的影响49
• 2.2.6.4 不同培养时间对发酵液抑菌活性的影响49
• 2.2.6.5 不同培养基初始pH值对发酵液抑菌活性的影响49
• 2.2.7 植物乳杆菌MP166产抗菌物质的分离纯化49-55
• 2.2.7.1 抗菌物质活性的检测49
• 2.2.7.2 抗菌物质发酵液的制备49-50
• 2.2.7.3 硫酸铵盐析50
• 2.2.7.4 Sephadex G-25凝胶过滤层析50-51
• 2.2.7.5 透析51
• 2.2.7.6 旋转蒸发51
• 2.2.7.7 SP Sepharose Fast flow阳离子交换层析51-52
• 2.2.7.8 Tricine-SDS-PAGE52-54
• 2.2.7.9 质谱分析54
• 2.2.7.10 MP166产抗菌物质理化性质的测定54-55
• 2.2.8 MP166产乳酸菌素在食品贮存中的应用55-59
• 2.2.8.1 MP166产乳酸菌素在牛乳贮存中的应用55-57
• 2.2.8.2 MP166产乳酸菌素在肉制品贮存中的应用57-59
• 2.2.9 游离型大豆异黄酮MP166发酵条件的优化59
• 2.2.9.1 发酵温度对大豆异黄酮含量的影响59
• 2.2.9.2 初始pH对大豆异黄酮含量的影响59
• 2.2.9.3 接种量对大豆异黄酮含量的影响59
• 2.2.9.4 响应面优化59
• 2.2.10 发酵豆乳发酵特性的研究59-61
• 2.2.10.1 pH值的测定59-60
• 2.2.10.2 滴定酸度的测定60
• 2.2.10.3 活菌数的测定60
• 2.2.10.4 蛋白水解能力的测定60
• 2.2.10.5 脱水收缩性的测定60
• 2.2.10.6 发酵过程中游离型大豆异黄酮含量的测定60-61
• 3 结果与分析61-108
• 3.1 益生乳酸菌的筛选61-68
• 3.1.1 乳酸菌的分离纯化结果61
• 3.1.2 产细菌素乳酸菌的筛选结果61-63
• 3.1.2.1 酸排除实验结果61-62
• 3.1.2.2 过氧化氢排除实验结果62
• 3.1.2.3 蛋白酶敏感性62
• 3.1.2.4 产细菌素乳酸菌的抑菌谱62-63
• 3.1.3 酸耐受性63-64
• 3.1.4 胆盐耐受性64
• 3.1.5 HT-29细胞黏附性64-65
• 3.1.6 高产大豆异黄酮糖苷转化酶乳酸菌的筛选65-68
• 3.1.6.1 产 β-葡萄糖苷酶菌株的筛选结果65
• 3.1.6.2 大豆异黄酮的标准曲线65-66
• 3.1.6.3 发酵豆乳中大豆异黄酮的含量66-68
• 3.2 益生乳酸菌的鉴定68-70
• 3.2.1 益生乳酸菌的形态学鉴定和生理生化鉴定结果68
• 3.2.2 16S rRNA的PCR扩增及同源性分析68-70
• 3.3 L. plantarum MP166的生理活性70-75
• 3.3.1 对小鼠肠道菌群的影响70-71
• 3.3.2 对免疫器官指数的影响71
• 3.3.3 对SIgA的影响71-72
• 3.3.4 抗氧化能力72-75
• 3.3.4.1 体外抗氧化能力72-74
• 3.3.4.2 对小鼠血液抗氧化指标的影响74-75
• 3.3.5 安全性分析75
• 3.4 L. plantarum MP166的生长特性75-77
• 3.4.1 L. plantarum MP166的生长曲线75-76
• 3.4.2 L. plantarum MP166的产酸能力76
• 3.4.3 L. plantarum MP166产抗菌物质趋势76-77
• 3.5 L. plantarum MP166产乳酸菌素的培养基优化和培养条件优化77-82
• 3.5.1 培养基优化结果77-80
• 3.5.1.1 基础发酵培养基77-78
• 3.5.1.2 不同碳源对抗菌物质产量的影响78
• 3.5.1.3 不同氮源对抗菌活性组分产量的影响78-79
• 3.5.1.4 生长因子对抗菌活性组分产量的影响79
• 3.5.1.5 刺激因子对抗菌活性组分产量的影响79-80
• 3.5.2 培养条件优化80-82
• 3.5.2.1 不同接种量对抗菌物质产量的影响80
• 3.5.2.2 不同培养温度对抗菌物质产量的影响80-81
• 3.5.2.3 不同培养基初始pH值对抗菌物质产量的影响81
• 3.5.2.4 不同装液量对抗菌物质产量的影响81-82
• 3.5.2.5 不同培养时间对发酵液抑菌活性的影响82
• 3.6 L. plantarum MP166产生的抗菌物质82-91
• 3.6.1 硫酸铵盐析的最适浓度82
• 3.6.2 抗菌物质Sephadex G-25凝胶过滤层析结果82-83
• 3.6.3 抗菌物质SP Sepharose Fast flow阳离子交换层析结果83-84
• 3.6.4 抗菌物质的Tricine-SDS-PAGE结果84-85
• 3.6.5 抗菌物质的质谱鉴定与分析结果85-87
• 3.6.6 L. plantarum MP166产乳酸菌素的理化性质87-91
• 3.6.6.1 对热的稳定性87-88
• 3.6.6.2 对酸碱的稳定性88
• 3.6.6.3 对紫外线的稳定性88-89
• 3.6.6.4 对蛋白酶的敏感性89
• 3.6.6.5 对化学试剂的稳定性89-90
• 3.6.6.6 乳酸菌素的抑菌作用机制90-91
• 3.7 L. plantarum MP166产乳酸菌素在食品贮存中的应用91-100
• 3.7.1 L. plantarum MP166产乳酸菌素在牛乳贮存中的应用91-97
• 3.7.1.1 在原料乳贮存中的应用91-94
• 3.7.1.2 在消毒乳贮存中的应用94-96
• 3.7.1.3 对牛乳中李斯特菌的抑制作用96-97
• 3.7.2 L. plantarum MP166产乳酸菌素在肉制品贮存中的应用97-100
• 3.8 L. plantarum MP166在豆乳中的发酵特性100-108
• 3.8.1 游离型大豆异黄酮MP166发酵条件的优化100-104
• 3.8.1.1 单因素实验结果100-101
• 3.8.1.2 响应面优化结果101-104
• 3.8.2 豆乳的发酵特性104-108
• 3.8.2.1 发酵豆乳样品在发酵过程中酸度的变化105
• 3.8.2.2 发酵豆乳样品在发酵过程中活菌数的变化105-106
• 3.8.2.3 发酵豆乳样品在发酵过程中蛋白水解能力的变化106
• 3.8.2.4 发酵豆乳样品在发酵过程中脱水收缩性的变化106
• 3.8.2.5 发酵过程中游离型大豆异黄酮含量的变化106-108
• 4 讨论108-116
• 5 结论116-117
• 参考文献117-127
• 致谢127-128
• 攻读学位期间发表论文情况128

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