谷胱甘肽对激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞分化的影响

发布时间：2020-06-24 22:18

【摘要】：第一部分人骨髓间充质干细胞的体外分离、培养和生物学特性研究 目的；骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有无限增殖能力和多向分化潜能,在特定的条件下可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、血管内皮细胞等多种中胚层来源组织细胞,MSCs可用于临床治疗股骨头坏死、脊髓损伤、免疫相关疾病。本研究旨在探讨成人骨髓MSCs分离、纯化、培养及鉴定的方法,观察其向成骨细胞和脂肪细胞分化过程中形态学特征,检测在成骨分化过程中Runx2基因的表达情况和成脂分化过程中PPAR-Y基因的表达情况。 方法：无菌环境下抽取人股骨近端骨髓,采用密度梯度离心联合差异贴壁法分离骨髓MSCs,体外扩增和传代培养,使用计数板对细胞进行记数统计,流式细胞仪检测细胞表面标记CD34、CD45、CD90的表达情况。MTT法检测细胞的增殖能力。诱导培养基诱导人骨髓MSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化,观察形态学改变。并采用RT-PCR和Western blot方法检测在分化过程中Runx2和PPAR-γ的动态表达。 结果：原代和传代细胞呈纺锤状外观,生长增殖能力良好,骨髓间充质干细胞的生长曲线呈成“S”形,细胞表面抗原标记物CD90呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞和脂肪细胞的表型特征。在成骨诱导分化过程中,RT-PCR和Western blot检测结果显示随着诱导时间的增加,Runx2的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P0.05)。同样,经定向成脂诱导分化后,细胞分别呈现脂肪的表型特征,随着诱导时间的增加,PPAR-γ的表达也明显增加,与对照组相比有统计学差异(P0.05)。 结论：该方法能从人骨髓中高效分离和扩增MSCs,生物学性状稳定,具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的潜能,能为骨组织工程提供理想的种子细胞。 第二部分激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞数目、功能及分化能力变化的相关研究 目的：骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨成脂分化的动态平衡对维持人体内骨代谢稳态起着重要作用。在激素的干预下,骨代谢平衡被打破,进而产生异常的生理生化反应,最终演变发展为股骨头坏死。本文旨在研究激素性股骨头坏死患者MSCs的数目、功能和成脂成骨分化能力是否改变,并探讨氧化应激在分化过程中的作用。 方法：选取2012年9月-2013年12月就诊32例激素性股骨头坏死患者,21例外伤性股骨颈骨折患者。经患者书面同意和武汉协和医院伦理委员会审批后,在手术室无菌条件下抽取患者股骨骨髓10ml。经密度梯度离心贴壁法体外分离、培养MSCs,取第3代细胞进行实验。用10μM谷胱甘肽对股骨头坏死组MSCs进行干预,比较各组MSCs的集落形成能力,检测细胞内活性氧水平、细胞成骨和成脂分化能力以及关键因子的表达水平。 结果：激素性股骨头坏死组MSCs与股骨颈骨折组相比较,集落形成能力显著下降,活性氧水平显著升高(P0.05),谷胱甘肽干预后,集落形成能力升高,活性氧水平水平下降,与坏死组比较差异有统计学意义(P0.05)。诱导分化染色结果显示,激素性股骨头坏死组MSCs成骨分化能力低于股骨颈骨折组,而成脂分化能力高于股骨颈骨折组,谷胱甘肽干预组较股骨头坏死组成骨能力增强而成脂能力减弱。PCR和western blot结果表明,激素性股骨头坏死组Runx2、ALP的表达水平显著低于股骨颈骨折组(P0.05),谷胱甘肽干预后能上调Runx2、ALP的表达(P0.05)。PPAR-γ、C/EBP的表达情况恰好相反。 结论：激素性股骨头坏死患者MSCs数量和功能均下降,细胞内活性氧水平升高,成骨能力下降,成脂能力增强。谷胱甘肽可以通过降低细胞内活性氧的水平逆转这种变化。 第三部分谷胱甘肽在激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞功能失调中的作用 目的：细胞内氧化应激水平的异常增加是激素性股骨头坏死的重要原因,本研究的目的是评估抗氧化剂谷胱甘肽对激素诱导的人骨髓间充质干细胞内活性氧水平和成脂成骨关键因子表达水平的影响。 方法：用10μM的地塞米松处理人MSCs,模拟激素性股骨头坏死细胞模型,用不同浓度(5μ M,10μM,50μM)谷胱甘肽的对细胞进行干预,共5个组分别为：正常组(A组),激素诱导组(B组),5μM谷胱甘肽干预组(C组),10μM谷胱甘肽干预组(D组),50μM谷胱甘肽干预组(E组),在细胞培养7d后,流式细胞仪检测细胞内活性氧水平,real-time PCR和western bolt技术检测成骨成脂关键基因表达的水平,在细胞培养21后,油红0染色观察细胞成脂分化情况。 结果：激素诱导21d,油红0染色显示,MSCs出现明显的成脂分化。激素诱导7d,流式细胞仪结果显示,细胞内活性氧的水平增加,经谷胱甘肽干预后,细胞内活性氧的水平下降；real-time PCR和western bolt结果显示成脂转录因子PPAR-γ、C/EBP水平明显升高,成骨转录因子RUNX2、ALP水平明显下降(P0.05)。在谷胱甘肽干预后,细胞内PPAR-γ、C/EBP水平降低,RUNX2、ALP表达水平升高。10μM谷胱甘肽组(D组)和50μM谷胱甘肽组(E组)作用最明显,和5μM谷胱甘肽组(C组)比较,有统计学差异(P0.05)。 结论：谷胱甘肽可以通过降低细胞内活性氧的水平抑制人MSCs向成脂分化,增强成骨分化。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2

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本文编号：2728428