犬瘟热病毒反向遗传学操作系统的建立及其作为活病毒疫苗载体的研究

发布时间：2020-07-12 18:01

【摘要】：犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CD V)属于副粘病毒科麻疹病毒属,病毒粒子有囊膜,基因组为单股负链RNA,大小为15690nt。自基因组的3’端至5’端,依次为3’引导序列、结构蛋白(N、P、M、F、H、L)基因、5’尾随序列。CDV可感染肉食目大多数动物而致病,免疫接种是目前唯一有效防治该病的措施。不分节段单股负链RNA病毒(Nonsegmented negative-strand RNA viruses, NNSVs)由于其只在细胞质复制,避免与宿主基因组发生整合,安全性高；病毒各蛋白的模块式表达方式,方便外源基因的表达；病毒基因组包装容量大,可插入长达4-5kb的外源基因；外源基因于重组病毒中能稳定、高效的得到表达等诸多优点,常用作重组疫苗载体的研究。CDV作为NNSVs的一员,有极大的作为活病毒疫苗载体的潜力。本课题拟建立弱毒株CDV-L反向遗传学操作平台,并探究其用作活病毒疫苗载体的潜力。对本实验室保存的弱毒株CDV-L进行序列测定,在此基础之上,分6段对CDV-L全长进行扩增,最后利用In-Fusion无缝连接技术构建病毒基因组全长cDNA克隆载体,并于基因组3’端引入T7RNA聚合酶启动子,5’端引入丁肝核酶序列。构建核衣壳蛋白N、P、L基因的辅助表达载体。建立了一株稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系BHK-T7,将上述各质粒共转染该细胞系成功拯救了rCDV-L。将EGFP基因插入CDV-L基因组P、M之间的非编码区,拯救成功的重组病毒感染细胞内有绿色荧光蛋白的产生,证明rCDV-L可作为载体表达外源蛋白。进一步,分别将狂犬病毒(Rabies virus, RV) Flury-LEP株G蛋白和水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus, MEV) VP2蛋白基因插入病毒基因组,拯救重组病毒rCDV-RV-G和rCDV-MEV-VP2并探究rCDV-L作为活病毒疫苗载体的能力。实验结果证实,rCDV-RV-G感染细胞内G蛋白得以表达,且插入到重组病毒粒子的囊膜中。rCDV-RV-G免疫小鼠和狗,二者体内均能产生抗CDV和RV的中和抗体,证明rCDV-RV-G具有双价疫苗的潜质,rCDV-L具有活病毒疫苗载体的能力。重组病毒rCDV-MEV-VP2, VP2基因的插入虽然不影响病毒的拯救,但病毒感染的细胞内检测不到VP2的表达。将VP2-N端一段具有抗原表位的小肽段基因与G蛋白基因进行无缝连接,重组病毒rCDV-G-VN感染细胞内虽然有外源蛋白的表达,但将重组病毒rCDV-G-VN免疫小鼠,免疫小鼠血清中未能检测到MEV的中和抗体。具体原因有待进一步研究。本课题成功构建了CDV-L反向遗传学操作平台,并证实CDV-L具有一定的活病毒疫苗载体的潜质。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：

共因,自热,犬瘟热病毒,基因组结构

I图1-1犬瘟热病毒基因组结构示意田（Fields Virology, 5th Edition)Figure 1-1 Genetic map of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)P glycoprotein spike柳 glycopro^丨n spike“pid bilaymM proteinRNA + N + P . L图1-2犬疲热病毒结构示意图（Fie丨ds Virology，5th Edition)Figure 1-2 Schematic diagram of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)1.2.1 核蛋白（Nucleocapsid protein，N)CDV的N蛋内基因长度为1683 nt,仅有一个开放阅读框（Open reading frame，ORF)，起始丁第108-110位的AUG,终止丁?第1677-1679位的UAA，共编码523个氨基酸，分子量约为58 kDa。在CDV的结构蛋内中，N蛋Qg是第一个被翻译出来的

结构示意图,犬瘟热病毒,纤突,基因组结构

由细胞膜衍生而来，膜农而含病毒糖蛋lU H、F, 二者形成1.3 nm纤突。囊膜内部含有非糖基化基质蛋lU M (图1-2)。M WWC M r MM I图1-1犬瘟热病毒基因组结构示意田（Fields Virology, 5th Edition)Figure 1-1 Genetic map of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)P glycoprotein spike柳 glycopro^丨n spike“pid bilaymM proteinRNA + N + P . L图1-2犬疲热病毒结构示意图（Fie丨ds Virology，5th Edition)Figure 1-2 Schematic diagram of canine distemper virus (Fields Virology, 5th Edition)1.2.1 核蛋白（Nucleocapsid protein，N)CDV的N蛋内基因长度为1683 nt,仅有一个开放阅读框（Open reading frame，ORF)，起始丁第108-110位的AUG,终止丁?第1677-1679位的UAA，共编码523个氨基酸，分子量约为58 kDa。在CDV的结构蛋内中，N蛋Qg是第一个被翻译出来的

高尔基体,C端,二聚体,文献综述

中B农业人学博士学位论文第一章文献综述QIMW组成，位丁?信号肽C端(von Messling and Cattaneo, 2002)。F蛋内通常是以三聚体的形式存在，多聚化过程发生在内质网中(Plemperet al.，200])。随后，F0 二聚体蛋内由内质网运向高尔基体，并丁?高尔基体中完成各种修饰，最重耍的就是由弗林蛋内_切割F0蛋内上特异位点RRQRRi ,形成由二硫键共价连接的n、F2亚单位(Bolt and Pedersen, 1998)。FO的切割是F蛋内A?备活性的必然过程。切割形成的F1由二部分纽成：N端强疏水性的融合肽、C端疏水性穿膜区以及C末端由33个氨基酸组成的胞内区_。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)中F蛋内结晶体的获得为F蛋ft空间结构的研究提供了直接证据，如图1-4所示，F蛋A单体相互缠绕形成二聚体，从侧面看分为头、颈、杆三部分，头部和颈部由F】、F2共同组成，杆部比较L<:，由122-171位氨基酸无规卷曲相互缠绕形成(Morrison, 2003)。

【共引文献】