拟南芥双特异性磷酸酶IBR5在温度依赖的防卫反应中的功能分析

发布时间：2017-03-31 08:11

  本文关键词：拟南芥双特异性磷酸酶IBR5在温度依赖的防卫反应中的功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：植物对病原菌的响应在进化过程中已经形成一套复杂而有效的机制,这其中,抗病(Resistance, R)蛋白通过识别不同病原菌效应因子,对激活植物ETI (Effector-Triggered Immunity)进程具有重要作用。低温是影响农作物产量和品质的重要的环境因素,作为非生物胁迫,低温常常影响植物对于病原菌的响应。一系列R蛋白可以在低温的状态下被激活,包括TIR-NB-LRR (Toll and Interleukin 1 Receptor-Nucleotide Binding-Leucine-Rich Repeat)类R蛋白SNC1及CHS2/RPP4。它们在正常情况处于非激活状态,当其NB结构域发生点突变后,突变形式的R蛋白在低温状态下可以被激活,使突变体在没有病原菌入侵的情况下,仍然激活免疫反应。我们在前期的研究工作中报道了一个冷敏感突变体chs3-1 (chilling sensitive 3), CHS3编码一个携带LIM (Lin-11, Isl-1和Mec-3)结构域的非典型TIR-NB-LRR类R蛋白。在LIM结构域中的点突变导致非正常剪切,形成一段截断蛋白。功能获得型突变体chs3-1在16℃具有免疫反应激活的表型,具体表现为植株矮小,叶片皱缩,出现细胞死亡、水杨酸(Salicylic acid, SA)和过氧化氢积累,PR(Pathogenesis Related)基因表达上调。遗传分析表明它的冷敏感表型依赖EDS1(Enhanced Disease Susceptibility 1)、SGTlb (Suppressor of the G2 allele of skp1)及RAR1 (Required for MLA12 Resistance 1)等R蛋白执行功能所必需的组分。为了进一步研究CHS3介导的温度依赖的免疫反应的分子机制,本论文对chs3-1进行抑制子筛选,鉴定其中一个抑制子是ibr5-7 (indole-3-butyric acid response 5),该突变体能够很大程度回复chs3-1低温下激活的防卫反应。IBR5编码一个预测的双特异性磷酸酶。已有文献报道缺失突变体ibr5对生长素和ABA均不敏感,IBR5通过去磷酸化MPK12 (Mitogen-Activated Protein Kinase12),参与调控生长素信号,而其在ABA信号途径的作用不依赖MPK12,目前IBR5在免疫反应中的作用没有报道。本论文研究结果表明,IBR5对CHS3的调控同样不依赖于MPK12。生化研究表明IBR5与CHS3的N端TIR结构域直接互作,将IBR5保守的磷酸酶功能位点突变不影响IBR5与CHS3的相互作用,却部分回复ibr5 chs3的冷敏感表型,证明IBR5的磷酸酶活性是其在CHS3介导的防卫反应中发挥功能所必需的。此外,低温下CHS3的转录水平及蛋白水平的积累均可以被ibr5抑制,说明IBR5是CHS3蛋白积累所必需的,并可能促进CHS3的表达。本研究中发现chs3-1的另一个抑制子是hsp90.3。结合之前研究发现的chs3-1的抑制子sgt1b及rarl-20的研究结果,暗示HSP90-SGT1b-RAR1复合体正调控CHS3介导的免疫反应。进一步生化结果表明,IBR5可以与HSP90及SGTlb在植物体内形成复合体,遗传分析发现IBR5与HSP90具有协同作用。这些结果表明IBR5与HSP90-SGT1b-RAR1形成复合体,共同保护CHS3。IBR5除了参与CHS3介导的防卫反应,还参与其他多种R基因介导的防卫反应。ibr5可以部分回复bal/sncl-2及bon1-1在22℃C的免疫反应,bal及bon1-1的表型都是由于体内SNC1(Suppressor of npr1-1, Constitutive 1)蛋白激活造成,IBR5可以与SNC1蛋白的TIR结构域互作,暗示IBR5可以直接调控SNC1的活性。此外,IBR5的突变还影响了植株对R蛋白RPM1 (Resistance to Pseudomonas Maculicola 1)及RPS4 (Resistant to Pseudomonas Syringae 4)介导的病原菌的抗病性,生化证据显示IBR5可以与RPS4在植物体内形成复合体。综上所述,IBR5可能参与了多种R蛋白介导的温度依赖的防卫反应调控。本研究结果为揭示植物响应低温与病原菌的分子机制提供了新的线索和证据。
【关键词】：拟南芥 温度 IBR5 CHS3 R蛋白
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q946
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略词表11-14
• 第一章 文献综述14-27
• 1.1 植物的天然免疫反应14-21
• 1.1.1 PAMP引发的基础免疫反应15-17
• 1.1.2 病原菌效应因子抑制植物的基础免疫反应17-18
• 1.1.3 R基因调控的次级免疫反应18-21
• 1.2 低温与植物免疫反应的联系21-24
• 1.3 分子伴侣在植物免疫反应中的作用24-25
• 1.4 本研究的目的和意义25-27
• 第二章 实验材料与方法27-40
• 2.1 实验材料27-29
• 2.1.1 植物材料27
• 2.1.2 菌株27
• 2.1.3 载体27-28
• 2.1.4 主要载体构建方法28-29
• 2.1.5 主要酶、抗体和试剂29
• 2.2 常用试剂和培养基配制29-33
• 2.2.1 台盼蓝(Trypan blue)染色试剂29
• 2.2.2 DAB染色试剂29-30
• 2.2.3 拟南芥转基因转化液30
• 2.2.4 烟草瞬时表达注射缓冲液30
• 2.2.5 原生质体转化相关试剂30-31
• 2.2.6 蛋白质免疫印迹(western blot)相关试剂31-32
• 2.2.7 植物DNA提取相关试剂32
• 2.2.8 植物蛋白提取缓冲液32
• 2.2.9 His标签蛋白纯化试剂32-33
• 2.2.10 常用培养基配方33
• 2.3 常用实验仪器33-34
• 2.4 实验方法34-40
• 2.4.1 植物生长条件34
• 2.4.2 转基因材料获得34-35
• 2.4.3 植物DNA提取35
• 2.4.4 植物RNA提取35
• 2.4.5 植物蛋白提取35
• 2.4.6 酵母蛋白提取35
• 2.4.7 Western blot35-36
• 2.4.8 Real-time PCR扩增36
• 2.4.9 免疫共沉淀(Co-IP)36
• 2.4.10 酵母双杂交36
• 2.4.11 萤光素酶互补成像(LCI)实验36-37
• 2.4.12 DAB染色37
• 2.4.13 台盼蓝染色37
• 2.4.14 接菌实验37-38
• 2.4.15 原生质体转化38
• 2.4.16 His标签蛋白表达及纯化38
• 2.4.17 Holdase活性检测38-40
• 第三章 实验结果与分析40-75
• 3.1 chs3-1抑制子的筛选与鉴定40-47
• 3.1.1 抑制子的筛选和遗传分析40-41
• 3.1.2 抑制子suc5的表型分析41-43
• 3.1.3 SUC5基因的图位克隆43-44
• 3.1.4 suc5的遗传互补分析44-45
• 3.1.5 ibr5-7是一个功能缺失突变体45-47
• 3.2 MPK12不参与IBR5对CHS3的调控47-49
• 3.2.1 功能缺失突变体mpkl2-3的鉴定47
• 3.2.2 mpk12-3生长素表型分析47-48
• 3.2.3 mpk12-3不能回复ibr5 chs3的表型48-49
• 3.3 IBR5与CHS3的TIR结构域直接相互作用49-53
• 3.3.1 IBR5与CHS3的TIR结构域在酵母中相互作用49-50
• 3.3.2 IBR5与CHS3的TIR结构域在植物体内相互作用50-52
• 3.3.3 IBR5的磷酸酶活性对其调控CHS3是必需的52-53
• 3.4 CHS3蛋白积累依赖IBR553-57
• 3.4.1 ibr5可以回复chs3-2D-GFP过表达植株防卫反应激活的表型53-54
• 3.4.2 chs3-2D蛋白积累依赖IBR554-55
• 3.4.3 IBR5促进CHS3的积累55-56
• 3.4.4 IBR5具有holdase活性56-57
• 3.5 IBR5与HSP90、SGT1b共同调控CHS357-64
• 3.5.1 hsp90.3是chs3的抑制子57
• 3.5.2 HSP90与IBR5具有协同作用57-59
• 3.5.3 IBR5与HSP90、SGT1b在体内形成复合体59-61
• 3.5.4 CHS3与HSP90、SGT1b在酵母中不能相互作用61-62
• 3.5.5 CHS3与SGTlb在植物体内形成复合体62-64
• 3.6 ibr5部分回复bal、bon1-1的防卫反应激活表型64-68
• 3.6.1 ibr5部分回复bal与bon1-1生长发育的表型64-65
• 3.6.2 ibr5部分回复bal与bon1-1细胞死亡的表型65
• 3.6.3 ibr5部分回复bal与bon1-1中的PR基因的表达65-66
• 3.6.4 ibr5部分回复bal与bon1-1的抗病表型66
• 3.6.5 IBR5与SNC1相互作用并促进其表达66-68
• 3.7 ibr5部分回复chs1的防卫反应激活表型68-70
• 3.7.1 ibr5不能回复chs1与chs2生长发育的表型69
• 3.7.2 ibr5部分回复chs1的PR基因表达69
• 3.7.3 IBR5可能负调控RPP4-1D的稳定性69-70
• 3.8 ibr5参与多种R基因介导的病原菌应答70-75
• 3.8.1 ibr5突变影响RPMl和RPS4介导的病原菌应答70
• 3.8.2 ibr5突变不影响RPS2介导的病原菌应答响应和基础防卫反应70-71
• 3.8.3 IBR5与RPS4在植物体内相互作用71-75
• 第四章 讨论与展望75-78
• 4.1 IBR5参与多种R介导的ETI免疫反应75-76
• 4.2 IBR5调控CHS3可能不依赖生长素及ABA信号途径76
• 4.3 IBR5与HSP90-SGT1b复合体共同调控CHS376-77
• 4.4 CHS3的作用机制77-78
• 第五章 结论78-79
• 参考文献79-92
• 附录92-95
• 致谢95-97
• 个人简介97

  本文关键词：拟南芥双特异性磷酸酶IBR5在温度依赖的防卫反应中的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：279242