秋茄叶绿体抗氧化防御基因KcCSD和KcTrxf的耐盐性功能分析

发布时间：2020-08-21 14:14

【摘要】：红树(Mangroves)生长在陆地和海洋之间的潮间带中,受到海水的周期性浸渍,兼具陆地与海洋双重生态特性,是典型的高等盐生植物。秋茄(Kandelia candel)是中国南海沿海滩涂主要的非泌盐红树。已有研究表明,在高盐胁迫下,秋茄根系会限制NaCl的吸收和运输。微阵列数据分析表明,盐胁迫下秋茄叶绿体中的抗氧化防御基因表达上调。然而,秋茄叶绿体中抗氧化防御关键基因铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD; KcCSD)、硫氧还蛋白(KcTrxf)在盐胁迫中的功能尚未研究。因此,本文以秋茄为实验材料,研究NaCl处理下(100-300 mM)秋茄对Na+吸收和运输的调控机理与活性氧清除机制,并且在烟草(Nicotiana tabacum L.)中异源表达KcCSD、KcTrxf基因,研究它们在植物抗盐性中的作用。在离子平衡方面,利用非损伤微测技术(Non-Invasive Micro-Test Technique)研究了秋茄根系对Na+的动态吸收与转运。Na+流的结果显示,短期和长期NaCl处理都会导致Na+外排。短期盐胁迫下,由H+-ATPase酶形成的质子梯度,驱动质膜Na+/H+逆向转运蛋白增强Na+的外排。长期盐胁迫下,秋茄根部Na+外排逐渐减少,导致Na+在根系中积累。当根系不能有效的限制Na+的吸收和运输时,根系中的Na+向上运输至叶片。叶片中的Na+累积,会提高叶中H202的水平,秋茄则通过调控活性氧清除系统来缓解盐胁迫。(1RT-PCR结果显示,NaCl处理后秋茄叶片中KcCSD的转录水平上调,同时叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)的活性增强。此外,NaCl处理后,KcTrxf的转录水平和非蛋白巯基(NPTs; non-protein thios)的含量均有所增加。氨基酸序列分析以及原生质体定位表明KcCSD是典型的叶绿体铜锌超氧化物歧化酶。与KcCSD类似,氨基酸序列分析与原生质体定位的结果显示KcTrxf也是定位于叶绿体中的蛋白质。为了研究这两个叶绿体蛋白在植物耐盐性中的作用,将KcCSD、 KcTrxf基因分别转入模式植物烟草中。NaCl处理后,野生型烟草幼苗的根长以及存活率均低于KcCSD转基因烟草。盐胁迫后,野生型烟草与转基因烟草的叶绿素含量、叶绿素a/b比值以及光合速率均明显下降。但是,在NaCl处理过程中野生型烟草下降更明显。而且,野生型烟草叶片中积累更多的丙二醛和H202,尤其是叶绿体中H202的积累远高于转基因烟草。叶绿体中活性氧的调控对于转基因烟草耐盐性有重要的作用。NaCl处理后,KcCSD转基因烟草通过调控胞内抗氧化酶的活性来缓解盐分对叶绿体的伤害。ROS普遍认为是第二信使,转基因烟草在胁迫过程中,叶绿体中光合电子传递链形成的超氧阴离子,作为信号反馈调节抗氧化系统,激活逆境下的适应和防御机制。SOD同工酶电泳结果显示,在100mM NaCl处理下(24h-7d),KcCSD转基因烟草中SOD同工酶活性增强,SOD的活性同样提高,增强了02-的歧化反应的产物H202。由02-歧化形成的H202,可以诱导过氧化氢酶(CAT)的活性提高。因此,在盐胁迫期间,KcCSD转基因烟草中可以减少叶绿体中活性氧的积累。盐胁迫下,KcTrxf转基因烟草一方面通过提高过氧化氢酶(CAT)以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性来清除H2O2；另一方面,KcTrxf转基因烟草通过调节叶绿体中抗坏血酸-谷胱甘肽循环中(AsA-GSH cycle)关键酶的活性来调节胞质还原状态,缓解氧化胁迫。NaCl处理后,KcTrxf转基因烟草中单脱氧抗坏血酸还原酶(MDAR)及谷胱甘肽还原酶(GR)的活性增强,还原型谷胱甘肽水平提高。同时,叶片中非蛋白巯基的含量上升。这有助于清除活性氧,缓解盐害引起的氧化胁迫。因此,与野生型烟草相比,转基因烟草在盐胁迫过程中,可以控制叶片中的活性氧积累,避免氧化损害,因此植株可以正常生长。总之,秋茄在短期盐胁迫下,通过根部Na+外排作用,有效排出Na+,缓解盐胁迫；而在长期高盐胁迫处理过程中,秋茄通过提高KcCSD和KcTrxf转录水平,增强抗氧化酶的活性,清除植物体内活性氧,保持胞内的氧化还原平衡,缓解盐诱导的氧化胁迫。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【图文】：

２．２．２邋ＮａＣｌ处理下秋前叶片中Ｈ２Ｏ２含量逡逑ＮａＣｌ处理三周中，叶片中Ｈ２Ｏ２含量随着处理时间变化而变化。ＮａＣｌ处理８邋ｈ后，逡逑叶片中Ｈ２Ｏ２含量达到最高值，为对照处理的３．６倍（图２－３）。长期ＮａＣｌ处理过程中，逡逑叶片中Ｈ２Ｏ２含量随着处理时间的延长逐渐下降（图２－３）。这些结果表明，随着处理逡逑时间的增长

ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ａｔＰ＜邋０．０５邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．逡逑２．２．３邋ＮａＣｌ处理下秋煎叶片中ＫｃＣＳＤ转录水平以及ＳＯＤ活性逡逑在ＮａＣｌ处理下，ｑＲＴ－ＰＣＲ结果显示秋琉中ＫｃＣＳＤ基因转录水平上调（图２－４），逡逑短期处理下（２４邋ｈ）后，转录水平表达量上调为对照处理的４倍（图２－４：）。长逡逑期ＮａＣｌ处理后，ＫｃＣＳＤ转录水平表达量上调为对照处理的１．８－２．９倍（图２－４）。并逡逑且在ＮａＣｌ处理中，秋莉叶片中ＳＯＤ活性也有不同程度的增强（图２－４）。以上结果表逡逑明，在ＮａＣｌ处理下秋莉中通过调节ＫｃＣＳＤ转录水平，增强ＳＯＤ的活性来清除活性逡逑氧。逡逑２３逡逑

ｌｅｔｔｅｒｓ邋ａｂｏｖｅ邋ｃｏｌｕｍｎｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ａｔ邋Ｐ邋＜邋０．０５邋ｄｕｒｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．逡逑２．２．４邋ＮａＣｌ处理下秋前叶片中转录水平以及ＮＰＴｓ含量逡逑在ＮａＣｌ处理下，ｑＲＴ－ＰＣＲ结果显示秋煎ｉ＾ｃＴｒｘ／基因的转录水平表达上调（图２－逡逑５）ｏ短期处理下（２４ｈ），转录水平表达量最高，为对照处理的３倍。长期ＮａＣｌ逡逑处理后（１＼＾和３＼＼０，转录水平表达量上调为对照处理的１．５倍。在ＮａＣｌ处逡逑理过程中，秋煎中非蛋白疏基（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎｔｈｉｏｌｓ；邋ＮＰＴｓ）的总量也有不同程度的上升逡逑（图２－５），上升幅度达３０％－８０％。此外，ＮＰＴｓ含量变化趋势与ｉＴｃＴｈｃ／表达量上调的逡逑结果相似：短期处理２４ｈ均达到最高峰（图２－５）。以上结果表明，在ＮａＣｌ处理下秋逡逑r:调控７＾６７＞１／的转录水平，调节胞质还原水平适应盐胁迫。逡逑２４逡逑

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