【摘要】：背景与目的:支原体感染后所致的炎症反应是其引起病理损伤的重要因素。研究显示,支原体的主要致炎物质膜脂蛋白及其衍生物巨噬细胞活化脂肽2(Mycoplasma macrophage-activating lipopeptide-2,MALP-2)可激活人单核、巨噬细胞并诱导其分泌一系列促炎细胞因子和介质,从而参与支原体感染后的免疫应答和病理损伤。血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)是催化血红素降解为Fe2+、一氧化碳和胆绿素的限速酶。HO-1及其产物对多种因素所致的氧化应激和炎症反应具有调控作用。研究显示,多种病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)作用于固有免疫系统后,可诱导单核-巨噬细胞及树突状细胞表达HO-1,从而发挥一定的免疫保护作用。本课题组前期研究也表明,MALP-2处理人单核细胞后,可激活核转录因子Nrf2并增强HO-1的活性,从而在一定程度上负向调控环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的表达,但其上游信号通路仍不明了。本研究旨在进一步研究MALP-2诱导HO-1表达的调控机制及其对细胞因子分泌的影响。方法:(1)体外培养人单核细胞系THP-1,用Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)或TLR6中和抗体孵育1h,或转染TLR2负显性突变体(Dominant negative TLR2,DN-TLR2)或DN-TLR6,随后用5ng/m L MALP-2刺激16h,Western blot观察阻断TLR2或TLR6后对HO-1蛋白表达的影响;构建HO-1启动子报告基因p GL3-HO-1-luc质粒,连同DN-TLR2或DN-TLR6转染THP-1细胞,观察MALP-2作用后HO-1启动子活性的改变情况,以证实TLR2和TLR6在介导HO-1表达中的作用;(2)MALP-2刺激THP-1细胞0~30min,Western blot分析c-Src的磷酸化情况;采用c-Src抑制剂PP1预处理细胞或转染c-Src si RNA,观察c-Src是否参与HO-1表达;(3)THP-1细胞用MALP-2刺激0~20min,Western blot分析Bruton’s酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)的磷酸化;采用PP1处理细胞,或用si RNA干扰c-Src表达,观察其对Btk磷酸化的影响,以证实c-Src是否参与Btk的激活;随后采用Btk抑制剂LFM-A13预处理THP-1细胞,观察其对HO-1蛋白表达及启动子活性的影响,以证实Btk在介导HO-1表达中的作用;(4)MALP-2刺激细胞前采用My D88或Mal si RNA干扰其表达,或采用DN-My D88或DN-Mal转染细胞,观察My D88和Mal对HO-1蛋白表达以及启动子活性的影响;(5)Western blot检测MALP-2刺激细胞0~60min后Akt的磷酸化情况;采用PP1和LFM-A13预处理细胞,或用Mal、My D88 si RNA分别沉默其表达,观察MALP-2处理后Akt的磷酸化情况,以证实c-Src、Btk、Mal或My D88是否参与PI3K的激活;随后采用PI3K抑制剂LY294002预处理细胞,观察PI3K是否参与HO-1表达;最后采用免疫共沉淀检测MALP-2处理后能否诱导形成c-Src/Btk/Mal/My D88/p85α复合体,以证实其直接相互作用;(6)采用LY294002处理细胞或转染My D88 si RNA,分别采用免疫荧光和凝胶迁移率实验观察核转录因子Nrf2的核转位和DNA结合活性,以证实MALP-2能否通过PI3K或My D88激活Nrf2;(7)细胞经MALP-2刺激前采用si RNA分别干扰HO-1或Nrf2的表达,或采用HO-1抑制剂锌原卟啉(Zinc protoporphyrin,Zn PP)处理,实时定量PCR检测TNF-α和IL-6 m RNA表达,ELISA检测TNF-α,IL-6,IL-10的分泌以及NF-κB的活性;构建pc DNA3.1-HO-1表达质粒并转染细胞使其过表达HO-1,或采用HO-1激动剂钴原卟啉(Cobalt protoporphyrin,Co PP)和莱菔硫烷(Sulforaphane,SFN)处理细胞,观察诱导HO-1表达后对TNF-α和IL-1β的分泌及NF-κB活性的影响,以证实HO-1在负向调控细胞因子分泌中的作用。结果:(1)TLR2或TLR6中和抗体预处理细胞后,可明显抑制MALP-2诱导THP-1细胞表达HO-1;同时,采用DN-TLR2或DN-TLR6转染细胞也可下调HO-1蛋白表达及其启动子活性;(2)MALP-2可诱导c-Src磷酸化;采用c-Src抑制剂PP1预预处理,或采用c-Src si RNA干扰其表达后,HO-1表达降低;(3)MALP-2处理THP-1细胞5min内即可诱导Btk磷酸化,10min后达到峰值,而PP1处理以及c-Src si RNA干扰后均可抑制Btk的磷酸化;此外,Btk抑制剂LFM-A13预处理后,HO-1蛋白表达以及其启动子活性显著降低;(4)采用si RNA沉默My D88或转染DN-My D88均不能下调HO-1表达,而转染Mal si RNA或DN-Mal可明显抑制MALP-2诱导HO-1表达;虽然转染DN-My D88可轻度抑制HO-1启动子活性,但其抑制效应明显低于DN-Mal转染组;(5)MALP-2刺激THP-1细胞5min后即可诱导Akt磷酸化,15min后到达峰值,c-Src和Btk抑制剂PP1和LFM-A13处理均可抑制其激活;RNA干扰Mal表达后,Akt磷酸化显著降低并将其低水平维持至120min以上。而转染My D88 si RNA并经MALP-2刺激15min后,Akt磷酸化明显降低,但60min后Akt磷酸化水平恢复正常;PI3K抑制剂LY294002预处理可明显抑制MALP-2诱导HO-1表达;此外,免疫共沉淀显示,MALP-2处理10min后可诱导c-Src/Btk/Mal/My D88/p85α形成复合体;(6)MALP-2处理1h可明显诱导Nrf2核转位并结合至HO-1的抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE);PI3K抑制剂LY294002处理后,Nrf2核转位以及DNA活性明显降低,而转染My D88 si RNA对Nrf2核转位以及DNA结合无明显影响;(7)RNA干扰HO-1或Nrf2表达可上调MALP-2诱导THP-1细胞表达并分泌TNF-α及IL-6,同时能增强NF-κB的活性,但对IL-10分泌无明显影响;采用HO-1抑制剂Zn PP处理也得到了类似结果;通过转染pc DNA3.1-HO-1使THP-1细胞过表达HO-1,或采用Co PP和SFN诱导HO-1表达,均可在一定程度上减少TNF-α和IL-1β分泌并下调NF-κB的活性。结论:(1)支原体MALP-2经TLR2,6/c-Src/Btk/Mal/PI3K/Nrf2通路诱导THP-1细胞表达HO-1;(2)HO-1可负向调控THP-1细胞分泌TNF-α和IL-1β。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R375
【图文】：
第 3 章 结 果第 3 章 结果2 经 TLR2 和 TLR6 诱导 THP-1 细胞表达 抗体抑制 MALP-2 诱导 THP-1 细胞表达 HO-1究当中，我们发现 MALP-2 可诱导 THP-1 细胞表面表达 TLR2 和 TLR6 受体。为了观察 TLR2 是否细胞刺激前先经 10μg/mL TLR2 中和抗体处理 1h，16h，Western blot 结果显示 TLR2 抗体处理后，与显降低（图 1-1）。
图 1-2. TLR2 负显性突变体抑制 HO-1 表达Donimant negative TLR2 inhibits MALP-2-induced HO-1ntly transfected with a dominant negative (DN)-TLR2. After ted with 5ng/mL of MALP-2 for another 16h. The cell lysatesS-PAGE for Western blot analysis of HO-1. Data shown rept experiments (means±SEM). *, P<0.05 for significant .抗体下调 HO-1 表达主要经TLR2和TLR6识别MALP-2。为了观察TLR6细胞经 1μg/mL TLR6 中和抗体预孵育后，再用 MA示 TLR6 中和抗体处理能抑制 HO-1 蛋白表达（图
图 1-3. TLR6 中和抗体下调 HO-1 蛋白表达ALP-2 induced HO-1 expression is inhibited by TLR6 neutralizere seeded in 6 well plate and preincubated with anti-TLR6 (1mg/ed with MALP-2 (5ng/mL) for 16h. HO-1 protein expression w and then densitometric analysis was performed after normalizati. Data shown represent results from three independent experiments (m, P<0.01 for significant difference between compared groups.显性突变体下调 HO-1 表达一步明确 TLR6 在介导 HO-1 表达中的作用，THP，再用 MALP-2 作用 16h。结果显示，与对照质粒组相（图 1-4）。
【共引文献】
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2802786
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