芸芥自交亲和相关基因的差异表达与克隆

发布时间：2020-08-26 03:45

【摘要】：芸芥(Eruca sativa Mill.)为孢子体自交不亲和植物,具有优异的抗逆能力,是十字花科作物育种的重要优良基因资源。自交亲和性可以使植株在自然状况下实现自交,利于其携带的有益基因的保留和累加,从而使植物自身的抗逆性增强,提高产量;并且还有利于选育优良自交系、利于种质保纯,增加品种的稳定性,延长种子的使用寿命。因此,研究已发现的芸芥自交亲和基因资源遗传机制以及克隆控制自交亲和性的特异基因在生物学和育种等方面具有重要意义。本研究以芸芥自交亲和系(Self-compatibility,SC)和自交不亲和系(Selfincompatibility,SI)开花前与开花后的花药和柱头为材料,采用14对引物组合进行mRNA差异显示PCR(Differential Display Reverse Transcription PCR,DDRT-PCR)分析,以分离、克隆芸芥自交亲和基因;对部分差异片段进行了表达模式分析,以分析相关基因在芸芥亲和性调控中的作用机制;继而采用RACE技术克隆了候选基因果胶酸裂解酶的全长cDNA,并构建了植物表达载体。取得的主要结果与结论如下:1.在芸芥近等基因系SI和SC间筛选得到了11条差异片段。这些差异表达基因包含木葡聚糖半乳糖基转移酶、DnaJ伴侣蛋白、果胶酸裂解酶家族蛋白、40S核糖体蛋白s19-1和假设蛋白等。2.首次在芸芥花药中发现并克隆得到了全长为1657bp的果胶酸裂解酶(pectate lyase,PL)基因序列,命名为EsPL。其完整开放阅读框(Open Read Frame,ORF)为1371bp,编码456个氨基酸。3.EsPL基因编码蛋白质的特性分析表明,EsPL的等电点为9.42,蛋白质相对分子量为51.179kD,EsPL为亲水性蛋白;EsPL基因编码的蛋白存在信号肽,是一个分泌蛋白。N端有一个跨膜蛋白;二级结构预测结果显示,EsPL包含24.56%的α螺旋,29.61%的延伸链,13.16%的β-转角和32.68%的无规则卷曲。系统发生树分析发现,芸芥EsPL基因与十字花科芸薹属植物甘蓝型油菜(CDY09356.1)、白菜型油菜(XP_009129128.1)的PL基因亲缘关系更近。4.成功构建了芸芥EsPL基因植物表达载体,为进一步研究芸芥EsPL基因的亚细胞定位和瞬时表达以及在白菜型油菜中的转化表达奠定了基础。5.首次在芸芥自交亲和系柱头中获得分子伴侣蛋白DnaJ同源基因esAtJ3。该基因含有一个长度为297bp的完整开放阅读框,编码98个氨基酸残基,含有一个DnaJC保守结构域,属于植物DnaJ超家族。esAtJ3基因无信号肽,是一个亲水性蛋白;二级结构预测表明esAtJ3基因主要由不规则卷曲和α螺旋组成。将esAtJ3基因与原核表达载体pET32a相连构建重组载体pET32a-esAtJ3,把重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导重组菌,经SDS-PAGE电泳分析,获得分子量约为31kD的重组esAtJ3蛋白。6.表达模式分析表明,木葡聚糖半乳糖基转移酶基因在SC开花前柱头中表达量最大;SC8假设蛋白在芸芥SC开花后花药中表达量最大;esAtJ3基因在芸芥SC开花前柱头中表达量较高;EsPL在芸芥开花后SC花药中的表达量显著高于SI花药中表达量,初步推测这些差异基因可能在芸芥SI和SC性状调控过程中发挥重要作用。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2

【参考文献】