穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌坏死性肠炎及气性坏疽的治疗作用机制

发布时间：2020-10-29 13:49

　　 产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌,可引起人类和动物的多种疾病。该菌主要引起人的气性坏疽和食物中毒,被美国疾病控制和预防中心列为最常见的食源性疾病诱因。在家禽中,产气荚膜梭菌是引起坏死性肠炎——一种对全球家禽业具有重要经济影响的疾病——的关键病原体。IV型菌毛(Type IV pili,TFP)是一种由主要菌毛蛋白掺杂少量次要菌毛蛋白聚合而成的菌体表面纤维状细丝。TFP介导细菌的多种功能,例如滑动运动、生物被膜形成、对宿主细胞的粘附及DNA摄取。其中,TFP依赖性的细胞粘附是产气荚膜梭菌成功定植的第一步,缺乏TFP介导粘附能力的突变株对宿主细胞的粘附能力大幅降低。此外,在TFP的存在下,产气荚膜梭菌可在宿主细胞表面形成生物被膜并增加毒素产生。产气荚膜梭菌溶素O(Perfringolysin O,PFO)是一种胆固醇依赖性溶细胞素,存在于几乎所有产气荚膜梭菌菌株之中。有研究表明,PFO在坏死性肠炎中与产气荚膜梭菌α毒素具有协同作用,并且PFO介导的细胞毒性可能是产气荚膜梭菌在宿主组织中得以存活的重要因素。因此,TFP及PFO有望成为抗产气荚膜梭菌感染的潜在药物靶标。在本研究中,我们首先以产气荚膜梭菌TFP介导的滑动运动试验及PFO介导的溶血活性试验为筛选表型,从天然化合物中筛选并得到了能够同时抑制TFP介导的滑动运动及PFO介导的溶血活性的天然化合物——穗花杉双黄酮。随后,我们通过滑动运动试验、生物被膜形成试验、最小抑菌浓度试验、生长曲线试验、细胞粘附试验详细研究了穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌TFP生物学活性及粘附能力的影响,并在电子显微镜下观察了穗花杉双黄酮处理后菌体表面菌毛的形态。之后,我们通过溶血试验、细胞毒性试验研究了穗花杉双黄酮对PFO生物学活性的影响,并通过分子模拟、点突变试验及寡聚化试验研究了穗花杉双黄酮与PFO相互作用的分子机制。进一步,在体内试验中,我们通过小鼠腿部感染产气荚膜梭菌建立了小鼠气性坏疽模型,检测了穗花杉双黄酮对感染小鼠死亡率、组织中细菌存活率及组织损伤的影响。最后,我们通过对肉鸡感染产气荚膜梭菌建立了坏死性肠炎模型,通过肉鸡肠道胀气情况、出血情况、粪便情况等指标检测了穗花杉双黄酮对坏死性肠炎的治疗效果,并检测了穗花杉双黄酮对肉鸡肠道内梭菌目相对丰度的影响。我们的结果表明:第一,穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌TFP介导的滑动运动及PFO介导的溶血活性具有显著的抑制作用。第二,穗花杉双黄酮在4或16μg/mL的浓度下对产气荚膜梭菌TFP依赖性的滑动运动、生物被膜的形成及粘附至Caco-2细胞能力具有显著的抑制作用,且这一作用不是通过抑菌或杀菌活性实现的。电子显微镜下观察,我们发现穗花杉双黄酮处理后导致产气荚膜梭菌菌体表面菌毛缺失,说明穗花杉双黄酮是一种潜在的TFP抑制剂。第三,穗花杉双黄酮在2或4μg/mL的浓度下可显著抑制PFO介导的溶血活性和对Caco-2细胞的细胞毒性,S190、S193、N199、V375及N377是穗花杉双黄酮与PFO相互作用的关键靶点,对关键氨基酸残基进行点突变后,穗花杉双黄酮对PFO介导溶血活性的抑制作用显著下降。在寡聚化试验中,穗花杉双黄酮能够抑制PFO的寡聚化过程。第四,在小鼠气性坏疽感染模型中,穗花杉双黄酮可以延长感染小鼠的存活时间,降低感染小鼠组织内的细菌存活率,有效地减轻了病理损伤。第五,在肉鸡坏死性肠炎模型中,我们发现通过给予穗花杉双黄酮可以有效缓解产气荚膜梭菌坏死性肠炎引起的肠道胀气、肠壁出血等病理性损伤,并能够降低肠道内厚壁菌门、梭菌纲及梭菌目的相对丰度。总之,我们的结果表明穗花杉双黄酮是一种潜在的TFP抑制剂,其处理后导致产气荚膜梭菌菌体表面TFP缺失,进而显著降低其对宿主细胞的粘附能力。同时,穗花杉双黄酮也是一种PFO抑制剂,可通过靶向PFO的关键氨基酸残基,抑制PFO的寡聚化,从而显著抑制PFO介导的细胞毒性。由于TFP及PFO介导的毒力对于病原菌的致病力具有决定性作用,穗花杉双黄酮对产气荚膜梭菌感染引起的气性坏疽及坏死性肠炎具有良好的保护作用,具有进一步研发的潜力。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

革兰氏阳性菌中TFP关键组分示意图如图2.1所示,其中关键的组分主要有主要菌毛蛋白PilA、负责组装功能的ATP酶PilB、内膜核心蛋白PilC、用于修饰菌毛前体蛋白的转肽酶PilD及负责收缩菌毛的ATP酶PilT[106]。可见,TFP骨架是由数千个分子的PilA螺旋形排列聚合而成的大分子蛋白多聚体。PilA首先在菌体内合成具有信号肽的菌毛前体,该信号肽富含碱性氨基酸残基并且在切割位点之前的1位氨基酸残基通常为甘氨酸。TFP分为两个亚型,IVa型的菌毛蛋白信号肽具有5至7个氨基酸残基,以苯丙氨酸作为成熟蛋白的1位氨基酸残基,而IVb型的菌毛蛋白具有更长的信号肽(最多26个氨基酸残基)并且在成熟时以除苯丙氨酸之外的疏水性氨基酸残基作为N端。菌毛前体蛋白通过Sec途径分泌系统穿过内膜,在内膜的细胞质侧,信号肽序列被专门负责修饰菌毛前体蛋白的膜结合转肽酶PilD识别并在保守的-1位的甘氨酸及1位的苯丙氨酸(或除苯丙氨酸之外的疏水性氨基酸残基)之间进行裁切以切除信号肽序列,之后经过N端修饰,将菌毛前体蛋白加工为成熟的菌毛蛋白PilA[107-109]。

产气荚膜梭菌的pilT基因并不位于主要或次要TFP操纵子区(图2.2C),其与艰难梭菌的PilT氨基酸序列同一性达56%,与铜绿假单胞菌PilT的同一性为50%[112]。有研究表明,产气荚膜梭菌pilT突变株不能够形成TFP,菌体表现为无可观测到的菌毛状态,说明pilT对于形成完整的菌毛至关重要[106]。除主要菌毛蛋白外,细菌还会表达少量次要菌毛蛋白,粘附于TFP骨架尖端[113],次要菌毛蛋白与主要菌毛蛋白具有N末端序列同源性,说明次要菌毛蛋白可能源自于主要菌毛蛋白的一部分,目前的研究表明次要菌毛蛋白负责优化菌毛骨架的组装或收缩,影响菌毛功能[114-118]。

对于TFP的详细装配过程目前尚未完全研究透彻,最为广泛的被学界认同的一种装配模型如图2.3所示。在菌毛装配的过程中,细胞质内合成的PilA穿过内膜层,募集到装配部位,由其带负电荷的第5位谷氨酸残基(图2.3中红色-)和带正电荷的N端1位的苯丙氨酸(或除苯丙氨酸之外的疏水性氨基酸残基)氨基酸残基(图2.3中蓝色+)之间的电荷互补吸引至正在装配的PilA基底部。PilB位于胞质中,通过结合ATP,ATP酶PilB发生构象变化,通过推动内膜核心蛋白,将PilC向细胞膜外侧推动一小段距离(约8-10?),PilC作为杠杆,进一步推动募集在装配区域的PilA基底部,在菌毛基底部周围开放一个新的间隙,用于新的PilA进入装配部位。PilB水解ATP后,恢复原有的空间构象,之后重复循环,依次将PilA添加到TFP骨架基底部,最终由数千个分子的PilA螺旋形排列聚合而成完整的TFP骨架[119-123]。最后,管家分选酶将TFP骨架基底部连接到细胞壁肽聚糖的氨基,完成TFP骨架的全部装配及锚定至细胞表面的过程[101]。对于TFP的收缩,可能与其组装过程相反,并涉及收缩菌毛的ATP酶PilT,PilT诱导菌毛分解的机制尚不清楚,但对于单个PilT,用于菌毛收缩过程产生的收缩力经测量可>100 pN,是目前为止发现的作用力最强的生物马达,这一强大的收缩力结合PilB产生的推动力赋予了TFP伸缩运动的能力,进而使得表达上述菌毛相关蛋白的细菌具有了TFP依赖的运动性[124-126]。
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本文编号：2860989