禾谷镰刀菌MCM1基因的功能研究

发布时间：2020-11-18 20:30

　　 在真核生物细胞中MADS-box基因通过与其它转录因子互作调控多种生物过程。在酵母,植物,昆虫,线虫,哺乳动物和低等的脊椎动物中都有MADS-box蛋白的存在。目前,植物的数据库中有上百种MADS-box结构域的蛋白。这些蛋白都具有保守的DNA结合和二聚体化结构域(MADS-box结构域)。目前MADS-box五个家族成员已被发现,酵母中的Mcm1和Arg80,拟南芥中的Agamous,人类中的Deficiens和SRF。赤霉基因组中含有两类MADS-box转录因子,其中之一与酵母的MCM1同源,属于SRF类的MADS-box转录因子(I型),在酵母中MCM1的敲除突变体是致死的;另外一个与酵母当中的Rl M1同源,属于MEF2类的MADS-box转录因子(II型)。Mcm1蛋白在各种生物过程中都发挥着重要的作用,包括微小染色体维持蛋白,新陈代谢,细胞识别和信息素应答。本研究鉴定了禾谷镰刀菌中MADS-box蛋白Fg Mcm1的功能。Fgmcm1突变体的分生孢子产量与野生型相比大约降低了2000倍,突变体不能够产生产孢结构?瓶梗,孢子直接在菌丝顶端产生。Fgmcm1突变体在分生孢子的形态上也有缺陷,77.2±5.6%的分生孢子有1-3个细胞。19.9±1.7%的分生孢子顶端有一个细胞是断裂的,通过(DAPI/Calcoflour)染色发现断裂的分生孢子与顶端是相连的。野生型的分生孢子每个细胞含有单个细胞核,而突变体的分生孢子每个细胞里有多个细胞核。这些观察结果表明Fg MCM1调控瓶梗和分生孢子的发育。有性阶段,Fgmcm1敲除突变体不产子囊壳,这说明Fg MCM1在调节有性生殖过程中发挥着重要的作用。Fgmcm1突变体对氧化还原和膜胁迫都降低了敏感性。通过扬花盛期的小麦穗、玉米秆侵染实验证明,Fgmcm1突变体无论在致病性和DON的产量上都严重降低。通过随机插入带有MCM1自身启动子的MCM1-GFP融合片段到Fgmcm1突变体中,获得MCM1基因互补转化子。互补转化子分生孢子形态、产量,DON产量和致病性等方面都恢复到野生型状态。亚细胞定位实验表明,Fg MCM1-GFP信号无论在孢子还是菌丝中都定位在细胞核。大约50%的Fgmcm1突变体的菌落形态是不稳定的,能够产生菌落形态特别小的菌株MD(例如MD1,MD2),在各种固体培养基中,包括CM,MM和5×YEG都存在类似现象。MD的菌丝宽度是不规则,菌落能够长出类似于扇形的角变菌落,将这些突出的扇形角变菌落重新接种,其生长速度能够恢复到Fgmcm1突变体的状态。在异宗配合的轮枝镰孢菌敲除Fvmcm1突变体,并没有发现菌落形态不稳定的现象。与野生型比较,类似于Fgmcm1突变体,Fvmcm1突变体的产孢率(包括大孢子和小孢子),真菌毒素FB1的产量,均出现显著下降。Fvmcm1突变体的瓶梗也是缺陷的,要比野生型细而长。在萌发条件下,小孢子能够直接萌发产生小孢子,这可能是由于Fv MCM1的敲除导致细胞之间的识别缺陷所引起的。酵母双杂交实验表明Fg Mcm1既与Mat1-1-1互作也和Fst12互作,而这两个转录因子对有性生殖都是至关重要的。Fgmcm1 mat1-1-1双突变体的菌落形态是稳定的,生长速度与Fgmcm1突变体相同,而Fgmcm1 fst12双突变体的菌落形态是不稳定的,大约有42.6﹪的Fgmcm1 fst12双突变体能够产生菌落形态生长发育不良的表型。这就说明Fgmcm1突变体菌落形态不稳定的现象可能是由于Fg MCM1的敲除导致与配体位点的基因互作发生变化而引起的。RNA-seq分析表明,相对于突变体Fgmcm1菌株,在生长缺陷菌株MD1中,一定数量的与有性生殖相关的基因在MD1里是上调表达的,这就进一步说明为什么MD1的生长速度是受限制的。与野生型相比较,与致病性、次生代谢和产孢相关的基因在突变体Fgmcm1是下调表达的。综上所述,在禾谷镰刀菌中,Fg Mcm1在调控瓶梗、分生孢子的形成,有性生殖,致病性,次生代谢和细胞识别过程中都发挥着至关重要的作用。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S432.44
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩写表
第一章 前言
    1.1 禾谷镰刀菌简介
    1.2 轮枝镰孢菌简介
    1.3 MADS-box功能介绍
    1.4 MADS-box蛋白的特征
    1.5 酵母菌的MADS-box蛋白简介
        1.5.1 酵母菌的SRF型MADS-box蛋白
        1.5.2 酵母菌的MEF型MADS-box蛋白功能介绍
    1.6 黑粉菌的MADS-box蛋白功能介绍
    1.7 稻瘟菌的MADS-box蛋白功能介绍
        1.7.1 稻瘟菌的Mig1（MEF型）对致病性的影响
        1.7.2 稻瘟菌的Mcm1（SRF型）对致病性的影响
    1.8 大孢粪壳菌的MADS-box蛋白功能介绍
    1.9 曲霉菌的MADS-box蛋白功能介绍
    1.10 禾谷镰刀菌的MADS-box蛋白
第二章FGMCM1 基因结构及敲除突变体的分析
    2.1 材料、试剂与仪器
        2.1.1 材料
        2.1.2 试剂
        2.1.3 仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 Split PCR方法构建MCM1 敲除突变体
        2.2.2 野生型禾谷镰刀菌原生质体的制备和转化
        2.2.3 Fgmcm1 突变体的筛选和鉴定
        2.2.4 PH-1 及突变体基因组DNA的提取—CTAB法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 FgMCM1 基因及蛋白序列分析
        2.3.2 Fgmcm1 基因敲除突变体的构建
        2.3.3 PCR检测所得到的转化子
        2.3.4 Southern blot验证
    2.4 讨论
第三章MCM1 在真菌发育过程中的调控作用
    3.1 材料、试剂和仪器
        3.1.1 材料
        3.1.2 试剂
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌落形态，菌落边缘及生长速度测定
        3.2.2 Fgmcm1 突变体的孢子形态，产孢率及萌发实验
        3.2.3 有性生殖实验
        3.2.4 压力筛选实验
        3.2.5 小麦穗与玉米杆接种实验
        3.2.6 Mcm1 蛋白的表达亚细胞定位及功能恢复验证
    3.3 结果
        3.3.1 突变体的表型观察
        3.3.2 对无性生殖的影响
        3.3.3 突变体Fgmcm1 对压力筛选的缺陷
        3.3.4 突变体Fgmcm1 致病性下降
        3.3.5 亚细胞定位及其蛋白表达
        3.3.6 MCM1 基因对有性生殖的影响
    3.4 讨论
第四章MCM1 对真菌细胞识别调控的作用
    4.1 材料、试剂和仪器
        4.1.1 材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
        4.1.4 培养基
    4.2 实验方法
        4.2.1 RNA提取，纯化及反转录
        4.2.2 酵母双杂的方法验证与FgMCM1 互作基因
        4.2.3 突变体M1M，M2M的获得
        4.2.4 轮枝镰孢菌中所涉及到的实验方法
        4.2.5 RNA-seqence测序及实时定量PCR
    4.3 结果
        4.3.1 突变体Fgmcm1 营养生长不稳定
        4.3.2 突变体MD的生长随机恢复
        4.3.3 在异宗配合的Fvmcm1 突变体对生长发育的影响
        4.3.4 酵母双杂验证蛋白的互作
        4.3.5 突变体M1M、M2M的构建
        4.3.6 Fgmcm1 与PH-1 比较基因表达的差异
        4.3.7 qRT-PCR实验与RNA-seq分析
        4.3.8 表达量变化的基因的功能验证
    4.4 讨论与展望
参考文献
附录
致谢
作者简介

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本文编号：2889171