小鼠着床前胚胎特异ERV相关长非编码RNA的定向筛选及功能研究

发布时间：2020-11-20 13:34

　　 着床前胚胎发育是一个受到精密调控的发育过程。研究着床前胚胎发育机制对于生殖生物学及再生医学都有深远意义,因此着床前胚胎发育一直倍受瞩目。在着床前胚胎发育过程中会发生一系列特异事件,如合子基因激活(zygote genome activation,ZGA)。长非编码RNA(long non-coding RNAs,lnc RNAs)参与调控已经成为新的生物学研究领域。随着测序技术的进步,大量lnc RNA在早期胚胎中被发现,但是,目前还没有研究能够回答有没有一些lnc RNA会参与到着床前胚胎发育调控过程中,如果有,这些lnc RNA以怎样的机制参与调控。内源逆转录病毒(Endogenous retroviruses,ERVs)是进化上内化于高等有颚脊椎动物基因组的逆转录病毒序列元件。内源逆转录病毒序列广泛分布,占人类基因组的8%,占小鼠基因组的10%。内源逆转录病毒序列曾一度被认为是垃圾DNA,但越来越多的证据表明,内源逆转录病毒序列参与了多方面生物学调控。病毒序列编码的蛋白质可参与宿主细胞功能。有些内源逆转录病毒尚保持转座能力,对于生殖细胞内基因重组等进化相关事件起到关键作用。我们早就知道小鼠ERV在着床前胚胎中转录,但具体发挥什么功能尚不清楚。是否存在ERV相关的lnc RNA参与着床前胚胎发育调控值得研究。我们针对ERVs的精心设计了半随机引物,通过半随机扩增,从小鼠早期胚胎各时期筛选m ERV相关未知转录本,经过分子克隆技术(链特异性PCR及RACE等)获得至少一个转录本全长,分析其是否为lnc RNA。对明确是lnc RNA的未知转录本进行亚细胞定位分析、表达模式分析以及功能研究。具体结果如下:通过PCR及测序结果的UCSC比对分析,我们鉴定出了36个新转录本。大部分新转录本(28/36)是ERV相关的,与预期相符。其中23个是GLN相关的,5个是Mu ERVL相关的;通过链特异性逆转录PCR以及RACE技术,我们发现lnc-GET是GLN,MERVL及MERVK相关的、可剪切的、有多聚腺苷酸尾的、含两种剪切突变体的RNA;Dyei是由GLN的LTR转录的、长665 nt的、GLN相关的、含3个外显子的RNA。亚细胞定位分析表明lnc-GET和Dyei定位于核,且主要是染色质定位的,因此lnc-GET和Dyei是非编码的。二级结构预测及mi RNA反义Northern印记实验排除了lnc-GET和Dyei是mi RNA前体的可能性。Taq Man定量PCR实验及RNA-FISH实验表明,lnc-GET是2-至4-细胞胚胎特异表达的,Dyei是4-细胞胚胎特异表达的;干扰lnc-GET导致胚胎发育阻滞于2-细胞时期,而干扰Dyei不影响着床前胚胎发育。干扰lnc-GET的胚胎在培养液中能维持2-细胞状态至少4天而不凋亡。干扰lnc-GET阻滞的胚胎呈Brd U强阳性、CAF1阴性,表明阻滞于G2时期,呈H3第10位精氨酸磷酸化(H3S10ph)染色阳性,表明阻滞于G2晚期。γH2A.X免疫荧光染色呈阴性,表明阻滞不是由于DNA损伤导致的。阻滞胚胎内,G2/M转换相关关键细胞周期蛋白依赖的蛋白酶CDK1以及母源蛋白OCT4和CDX2没有显著变化;主要合子基因激活(major ZGA)起始不受影响。我们还发现臂间卫星序列的正义链及反义链转录本表达水平没有变化,DNA-FISH结果显示臂间环已经变成了染色中心;通过低起始量RNA-seq我们比较了注射对照锁核酸(LNA)的对照晚期2-细胞胚胎(2225枚)与干扰lnc-GET的阻滞2-细胞胚胎(2042枚)在major ZGA时期的基因表达情况。总体上讲,在干扰lnc-GET的阻滞2-细胞胚胎中有723个基因上调,521个基因下调(FDR≤0.0001,RPKM≥1,2倍以上),多达11060个基因发生了异常剪切,表明干扰lnc-GET造成了major ZGA严重异常。KEGG通路分析表明干扰lnc-GET主要影响了MAPK信号通路,表现在ERK1/2-MAPK及LNK/p38-MAPK通路的核心因子表达量显著下降。异常剪切基因的GO-BP分析结果表明发生异常剪切的基因主要聚类于细胞周期相关基因(主要是M周期相关的)。表明干扰lnc-GET造成的阻滞可能是影响了细胞周期相关基因的转录及可变剪切导致的;我们通过pulldown-质谱来检测lnc-GET结合的蛋白,鉴定出了hn RNP U、FUBP1、DAZAP1及ILF2。这4个蛋白定位于晚期2-细胞及早期4-细胞核内,说明是与lnc-GET共定位的。这4个蛋白都是剪切复合体组分,3个是转录因子,表明pulldown-质谱结果与RNA-seq结果相符:lnc-GET可能参与了转录及剪切调控;无论通过Wilcoxon rank sum检验结合Benjamin多重检验,还是Wilcoxon rank single检验(p2.2×10-16)均发现DEGs倾向于富集在其相关的GLN,Mu ERVL及ERVK的LTR(GLK-LTRs)附近。因此lnc-GET可能是通过介导GLK-LTR的顺式调控元件的活性来实现转录调控的。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q132
【文章目录】：
摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 长非编码RNA研究现状
        1.1.1 lnc RNA与X染色体失活
        1.1.2 lnc RNA与基因印记
        1.1.3 lnc RNA与Hox基因簇调控
        1.1.4 lnc RNA与卵裂期染色中心形成
        1.1.5 lnc RNA与神经命运特化
        1.1.6 lnc RNA与ES多能性维持及分化
        1.1.7 lnc RNA与疾病
        1.1.8 lnc RNA与凋亡及细胞周期调控
        1.1.9 lnc RNA与免疫
        1.1.10 lnc RNA与线粒体调节
    1.2 lnc RNA调控的机制
        1.2.1 lnc RNA参与转录前调控
        1.2.2 lnc RNA参与转录调控
        1.2.3 lnc RNA参与转录后调控
    1.3 内源逆转录病毒
        1.3.1 内源逆转录病毒元件作为启动子或增强子或poly A
        1.3.2 内源逆转录病毒元件表达病毒蛋白参与细胞功能
        1.3.3 内源逆转录病毒相关转录本
    1.4 本研究的目的和意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要仪器设备
        2.1.3 主要试剂及试剂盒
        2.1.4 主要抗体
        2.1.5 常用试剂及配制
        2.1.6 主要的生物分析软件及网站
    2.2 实验方法
        2.2.1 半随机扩增筛选ERV相关lnc RNA
        2.2.2 链特异性PCR
        2.2.3 亚细胞定位分析
        2.2.4 表达模式分析
        2.2.5 5'RACE
        2.2.6 3'RACE
        2.2.7 RNA-FISH
        2.2.8 DNA-FISH
        2.2.9 胚胎Brd U免疫荧光检测
        2.2.10 胚胎EU检测
        2.2.11 mi RNA reverse Northern Blot
        2.2.12 RNA pulldown
        2.2.14 RNA干扰
        2.2.15 低起始量RNA-seq
        2.2.16 选择性剪切验证
3 结果与分析
    3.1 筛选出36个未知转录本
        3.1.1 半随机扩增
        3.1.2 UCSC比对筛选位置转录本
        3.1.3 部分新转录本在着床前胚胎表达模式分析
    3.2 lnc-GET及Dyei是lnc RNA
        3.2.1 lnc-GET及Dyei的全长分析
        3.2.2 lnc-GET及Dyei的蛋白编码能力分析
        3.2.3 lnc-GET及Dyei不是pri-mi RNA
    3.3 lnc-GET及Dyei的表达模式分析
    3.4 干扰Dyei不影响小鼠着床前胚胎发育
    3.5 干扰lnc-GET导致小鼠胚胎发育阻滞于 2-细胞晚期G2期
    3.6 lnc-GET干扰阻滞 2-细胞的特征
    3.7 lnc-GET与ILF2、hn RNP U、DAZAP1、FUBP1互作
    3.8 lnc-GET可能通过调控转录及RNA剪切实现其功能
4 讨论
    4.1 lnc RNA的半随机扩增筛选
    4.2 ERV在着床前胚胎内的功能
    4.3 lnc-GET的转录调控机制类似增强字样lnc RNA
    4.4 lnc-GET与CARM1的互作
    4.5 lnc-GET与选择性剪切
    4.6 lnc-GET的过表达
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘静;A Novel Vector for Abundant Expression of Antisense RNA, Triplex forming RNA and Ribozyme in vivo[J];High Technology Letters;2000年04期

2 鲁慧英;Detection of hepatitis C virus RNA sequences in cholangiocarcinomas in Chinese and American patients[J];Chinese Medical Journal;2000年12期

3 梁小兵 ,万国江 ,黄荣贵;Distribution and Variation of Ribonucleic Acid (RNA) and Protein and Its Hydrolysis Products in Lake Sediments[J];Chinese Journal of Geochemistry;2002年02期

4 Verheyden B ,徐其武;口服脊髓灰质炎疫苗核壳和RNA的稳定性[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;2002年01期

5 CMBE译文组;探索小RNA的功能[J];现代临床医学生物工程学杂志;2004年03期

6 沈维干;RNA interference and its current application in mammals[J];Chinese Medical Journal;2004年07期

7 孙娣;汪洋;张丽娟;闫玉清;;一种简捷提取植物总RNA的方法[J];黑龙江医药;2005年06期

8 南海波;;小麦总RNA的提取[J];渤海大学学报(自然科学版);2006年01期

9 王冬来;;RNA干扰的成功与困惑[J];中国生物化学与分子生物学报;2008年06期

10 杨静;;试验性的小RNA药物可能引发失明[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年05期

相关博士学位论文 前10条

1 王赵玮;昆虫RNA病毒复制及昆虫抗病毒天然免疫机制研究[D];武汉大学;2014年

2 包纯;一类新非编码RNA的发现以及产生和功能的初探[D];华中师范大学;2015年

3 李语丽;基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修饰的研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2015年

4 熊瑜琳;miR-122靶位基因STAT3调控长链非编码 RNA Lethe促进HCV复制的机制研究[D];第三军医大学;2015年

5 范春节;高通量测序鉴定毛竹小RNA及其功能分析[D];中国林业科学研究院;2012年

6 王加强;小鼠着床前胚胎特异ERV相关长非编码RNA的定向筛选及功能研究[D];东北农业大学;2015年

7 祝宇红;离子条件下RNA折叠稳定性的理论研究[D];浙江大学;2014年

8 刘立江;核盘菌新型RNA病毒研究[D];华中农业大学;2015年

9 刘雪梅;随机RNA文库技术的建立及其应用[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年

10 付汉江;非编码RNA克隆分析及其功能初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 陆聪儿;条纹斑竹鲨再生肝脏中差异RNA的研究[D];浙江理工大学;2015年

2 张晓辉;小鼠几种长链非编码RNA基因功能的初步研究[D];昆明理工大学;2015年

3 全弘扬;长链非编码RNA在细胞内质网应激反应中的相关作用及机制研究[D];北京协和医学院;2015年

4 胡亮;DDX19A识别PRRSV基因组RNA并激活NLRP3炎症小体[D];中国农业科学院;2015年

5 张帅兵;应用RNA干扰技术对旋毛虫Nudix水解酶基因功能的研究[D];郑州大学;2015年

6 郑芳芳;肺癌RNA-Seq数据中RNA编辑事件的识别算法和系统分析[D];苏州大学;2015年

7 陈瑞东;长链非编码RNA MEG3在胰腺癌发生发展中作用的实验研究[D];苏州大学;2015年

8 刘骏武;线虫和水稻中环状RNA的预测及分析[D];华中农业大学;2015年

9 李猷;利用RNA干扰技术提高番茄抗TMV侵染能力的研究[D];牡丹江师范学院;2015年

10 吴术盛;SVCV感染EPC细胞microRNA表达谱的初步研究[D];华中农业大学;2015年

本文编号：2891490