转录因子p8调控自噬的功能研究

发布时间：2017-04-08 11:16

  本文关键词：转录因子p8调控自噬的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞自噬是一种在进化上高度保守的、维持细胞稳态的生理过程,可以使细胞内部的长寿命蛋白、受损的细胞器等通过溶酶体降解。自噬与去除和降解错误折叠的蛋白质的内质网应激有着重要的联系,然而对于内质网在受到胁迫时如何引发和调控自噬的分子机制还不是完全清楚。很多研究表明磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)和雷帕霉素靶蛋白质(TOR)在自噬的调控中起着关键的作用。自噬对细胞生长、发育、再生、退行性疾病等的调控已经被广泛研究,但是在静息的细胞中,自噬调控的方式仍不清楚。由于卤虫在环境恶劣的条件下可以产生长时间静息的休眠胚胎,因此我们选择卤虫作为研究模型。我们发现,卵生途径中,休眠胚胎形成前期,自噬水平逐渐升高,而在休眠胚胎中自噬基本检测不到。Western blotting和RNA干涉检测的结果表明,卵生卤虫自噬并不是AMPK/TOR调控的。同时我们发现与应激相关的小分子转录因子p8 (Ar-p8)的表达特征与休眠胚胎形成过程中自噬的变化水平相一致,在休眠胚胎形成前期高量表达,但是在休眠胚胎中消失,暗示Ar-p8很可能与休眠胚胎形成过程中的自噬调控相关。使用双链RNA将休眠胚胎形成前期的Ar-p8干涉后,发现与对照组高水平的自噬相比,干涉Ar-p8组自噬降低,同时内质网自噬相关的分子转录因子4(ATF4)和转录因子6(ATF6)降低。进一步我们在人胃癌细胞系MKN45中过表达Ar-p8和人源转录因子p8 (Hu-p8),发现过表达Ar-p8和Hu-p8后肿瘤细胞自噬水平升高,但是AMPK/mTOR信号通路并不发生变化。同时,我们分别使用平衡盐缓冲液(EBSS)和棕榈酸(PA)对细胞进行胁迫处理,得到营养缺乏和脂肪毒性胁迫的细胞,引发自噬。Western blotting的结果显示AMPK/mTOR参与调控由营养缺乏引发的自噬,而脂肪毒性引发的自噬则是经由Hu-p8调控的。进一步的研究显示,AMPK/mTOR参与调控parkin介导的线粒体自噬,而Hu-p8参与调控由PERK/ATF6介导的内质网自噬。最后我们的研究确认了一条由细胞脂肪毒性引起的非AMPK/mTOR非依赖的自噬途径：在肿瘤细胞中,Hu-p8通过介导p53和PKCa参与了内质网自噬的调控。我们在卤虫休眠胚胎形成过程中的研究为进一步揭示静息细胞的自噬调控起到重要的作用,同时在肿瘤细胞中对自噬的研究为应对脂肪毒性引发的自噬提供了重要的理论依据。
【关键词】：自噬 卤虫 AMPK/TOR p8 MK<N45 脂肪毒性 营养缺乏
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q255
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 缩略词和术语表16-18
• 1 绪论18-28
• 1.1 研究背景18-27
• 1.1.1 卤虫概况18-19
• 1.1.2 胞自噬概况19-24
• 1.1.3 自噬调控信号通路的研究概况24-26
• 1.1.4 p8的研究概况26-27
• 1.2 展望27
• 1.3 研究目的、方法、意义27-28
• 2 材料与方法28-52
• 2.1 材料28-29
• 2.1.1 实验材料28
• 2.1.2 主要试剂28-29
• 2.1.3 主要仪器29
• 2.2 方法29-52
• 2.2.1 总RNA提取29-30
• 2.2.2 cDNA的合成30-31
• 2.2.3 分子克隆31-36
• 2.2.4 蛋白的原核表达与纯化36-37
• 2.2.4.1 检测表达产物是以可溶性物质还是以包涵体形式存在36
• 2.2.4.2 使用Ni珠纯化含有His标签的融合蛋白36-37
• 2.2.5 抗体制备37
• 2.2.6 Western blotting37-39
• 2.2.6.1 总蛋白提取37-38
• 2.2.6.2 蛋白样品检测及转膜38
• 2.2.6.3 抗体检测38-39
• 2.2.7 胶体金偶联免疫组化39-40
• 2.2.8 氨基酸序列比对,进化分析40
• 2.2.9 卤虫dsRNA干涉40-42
• 2.2.9.1 dsRNA表达质粒构建40
• 2.2.9.2 小量质粒抽提40-41
• 2.2.9.3 dsRNA的诱导表达及抽提41-42
• 2.2.9.4 卤虫的显微注射42
• 2.2.10 核质分离42-43
• 2.2.11 荧光定量PCR43
• 2.2.12 真核表达质粒的构建及抽提43-44
• 2.2.13 细胞培养、转染及药物处理44-46
• 2.2.14 流式细胞分选46-47
• 2.2.15 siRNA干涉47-50
• 2.2.15.1 siRNA合成47-49
• 2.2.15.2 siRNA转染49-50
• 2.2.15.3 半定量PCR50
• 2.2.16 细胞免疫荧光50-52
• 3 结果52-71
• 3.1 卤虫两种不同发育模式中自噬水平的分析52-56
• 3.1.1 Ar-ATG5和Ar-ATG8序列获得52-54
• 3.1.2 卤虫两种生殖方式中自噬的特征分析54-56
• 3.2 AMPK/TOR和Ar-p8分别调控卤虫两种生殖方式的自噬56-61
• 3.2.1 卤虫两种生殖方式中AMPK/TOR的蛋白水平分析56-57
• 3.2.2 卤虫休眠胚胎形成过程中Ar-p8调控自噬的分子机制57-59
• 3.2.3 卤虫Ar-p8调控内质网自噬的分析59-60
• 3.2.4 卤虫受到环境胁迫时引发AMPK/TOR调控的自噬60-61
• 3.3 p8诱导人胃癌MKN45细胞自噬水平上升61-64
• 3.3.1 Ar-p8在人胃癌MKN45细胞中引发AMPK/mTOR不依赖的自噬61-62
• 3.3.2 Hu-p8在人胃癌MKN45细胞中引发AMPK/mTOR不依赖的自噬62-64
• 3.4 Hu-p8调控由脂肪毒性引发的内质网自噬64-71
• 3.4.1 AMPK/mTOR和Hu-p8分别调控由营养缺乏和脂肪毒性引发的自噬64-67
• 3.4.2 营养缺乏引起线粒体自噬,脂肪毒性引起内质网自噬67
• 3.4.3 Hu-p8调控内质网自噬的分子机制67-71
• 4 讨论71-75
• 4.1 极低水平的自噬对卤虫休眠胚胎维持静息状态的重要作用71
• 4.2 Ar-p8调控的自噬可能是与休眠胚胎形成相关的主动调控的自噬71-73
• 4.3 p8对自噬的调控作用73
• 4.4 营养缺乏和脂肪毒性引发不同类型的自噬73-75
• 5 结论75
• 6 展望75-76
• 参考文献76-83
• 附录一 论文中使用的引物83-87
• 附录二 常用试剂配制87-93
• 作者简介93-94

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