基于CRISPR/Cas9的拟南芥多基因编辑及其在基因功能研究中的应用
发布时间：2021-01-30 07:03
随着“后基因组时代”的到来,一方面功能基因组学研究基因间相互作用、代谢调控网络的需求日益迫切,另一方面在植物生长发育过程中遗传冗余却大量存在,这种情况下,只有同时敲除多个基因或位点才能获得特定的能显现的表型,以达到为功能基因组学研究、遗传育种提供素材的目的。尽管随着基因组编辑技术的发展,近几年来在植株水平,对单个基因或同时对两个位点进行敲除编辑已经实现,但是如若想获得多个基因同时突变且稳定遗传的突变体,按照传统杂交育种思路,不但累加突变并纯合化的过程极为耗时,而且当突变基因个数增长到一定数量时,杂交后基因型检测的工作量之大也是难以承受的。除此之外,多个位点的同时敲除,对于像小麦、燕麦、烟草、棉花等多倍体植物的研究也非常有意义。尽管多基因/多位点同时敲除意义重大,虽然利用锌指蛋白酶、TALEN等基因组编辑技术于几年前实现了植物中单个基因的敲除,但是因为技术自身的局限性,植物中多基因敲除在整个植物学界进展缓慢。在我们TALEN基因组编辑技术应用成功后,改造用于多基因敲除TALEN技术的课题陷入僵局时,CRISPR/Cas9技术应运而生,因为CRISPR/Cas9系统含有转录后相互独立的Ca...
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
缩略词
1 引言
1.1 植物基因组与功能基因组学研究基础
1.1.1 立足全基因组水平、注重多基因间相互作用的“后基因组时代”
1.1.2 植物功能基因组研究的主要技术方法及其特点
1.2 基因组定点编辑技术的发展及其应用前景
1.2.1 锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）
1.2.2 类转录激活效应因子核酸酶（TALEN）
1.2.3 CRISPR/Cas9系统 （Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated systems）
1.2.4 基因组编辑技术的比较与CRISPR/Cas9在多基因敲除中的优势
1.3 单基因敲除、大片段删除及多个基因同时敲除策略
1.3.1 单个基因完全功能敲除
1.3.2 基因组大片段删除
1.3.3 同一个体中多基因同时敲除
1.4 突变体靶位点筛选方法比较
1.5 用于基因组编辑技术的植物（拟南芥、番茄）转化方法及检测时期
1.6 基因组编辑植物的生物安全性
1.7 研究意义及立题依据
1.8 本研究的技术路线
2 CRISPR／CAS9系统介导的拟南芥IDM3单个基因编辑敲除及IDM3参与去甲基化过程的研究
2.1 材料与方法
2.1.1 CRISPR／Cas9系统sg RNA的设计与表达载体的组装
2.1.2 转基因及转基因阳性植株筛选
2.1.3 突变体的筛选与鉴定
2.1.4 Chop-PCR检测idm3突变体的甲基化程度
2.2 结果与讨论
2.2.1 转基因个体及成功敲除个体的筛选
2.2.2 IDM3促进拟南芥的去甲基化过程
2.3 小结
3 运用CRISPR /CAS9系统通过基因组长片段删除敲除单个基因
3.1 材料与方法
3.1.1 用于长片段删除的sg RNAs设计与表达载体组装
3.1.2 转基因及转基因阳性植株的筛选
3.1.3 CRISPR/Cas9系统介导的拟南芥基因组长片段删除
3.2 结果与讨论
3.2.1 T1代AFLP检测筛选及测序结果
3.2.2 T2代大片段删除检测及稳定株系的获得
3.3 小结
4 拟南芥PYL基因家族多基因敲除突变体库的构建与基因功能初步研究
4.1 材料与方法
4.1.1 拟南芥PYLs多基因敲除sg RNA设计与表达载体组装
4.1.2 转化植株及PYLs多基因突变体库筛选方法
4.2 结果与讨论
4.2.1 转基因及多基因敲除个体的筛选
4.2.2 T2纯合多基因突变体的获得及表型和基因功能初步分析
4.3 小结
5 CRISPR/CAS9系统的广适性验证
5.1 材料与方法
5.1.1 用于番茄基因敲除的sg RNA设计与表达载体组装
5.1.2 番茄组织培养转化与诱导成苗
5.2 结果与讨论
5.2.1 转基因个体及成功敲除个体的筛选
5.3 小结
6 总结与展望
7 创新点
致谢
参考文献
附录1
A. 博士期间发表及待发表的文章
附录2
A. 文中涉及关键基因或原件的序列
B. 文中所用部分引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA甲基化与基因表达调控研究进展[J]. 史玉杰,李庆贺,刘晓辉. 中国生物工程杂志. 2013(07)
[2]RNAi机制及在植物中应用的研究概述[J]. 崔喜艳,孙小杰,刘忠野,张继伟. 吉林农业大学学报. 2013(02)
[3]水稻功能基因图位克隆研究进展[J]. 童继平,刘学军,韩傲男,马忠友,刘敏. 中国生物工程杂志. 2012(03)
[4]我国转基因植物研发形势及发展战略[J]. 万建民. 生命科学. 2011(02)
[5]植物RNAi的特点及其应用研究进展[J]. 白描,杨国顺,陈石,张美玲. 生物技术通报. 2009(08)
[6]反向遗传学在现代生物学领域中的应用[J]. 杨宇,王丹,李浩戈. 生物技术通报. 2009(05)
[7]功能基因组学的研究内容与方法[J]. 赵剑华,王秀琴,刘芝华,吴. 生物化学与生物物理进展. 2000(01)
本文编号：3008477
【文章来源】：重庆大学重庆市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
缩略词
1 引言
1.1 植物基因组与功能基因组学研究基础
1.1.1 立足全基因组水平、注重多基因间相互作用的“后基因组时代”
1.1.2 植物功能基因组研究的主要技术方法及其特点
1.2 基因组定点编辑技术的发展及其应用前景
1.2.1 锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）
1.2.2 类转录激活效应因子核酸酶（TALEN）
1.2.3 CRISPR/Cas9系统 （Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated systems）
1.2.4 基因组编辑技术的比较与CRISPR/Cas9在多基因敲除中的优势
1.3 单基因敲除、大片段删除及多个基因同时敲除策略
1.3.1 单个基因完全功能敲除
1.3.2 基因组大片段删除
1.3.3 同一个体中多基因同时敲除
1.4 突变体靶位点筛选方法比较
1.5 用于基因组编辑技术的植物（拟南芥、番茄）转化方法及检测时期
1.6 基因组编辑植物的生物安全性
1.7 研究意义及立题依据
1.8 本研究的技术路线
2 CRISPR／CAS9系统介导的拟南芥IDM3单个基因编辑敲除及IDM3参与去甲基化过程的研究
2.1 材料与方法
2.1.1 CRISPR／Cas9系统sg RNA的设计与表达载体的组装
2.1.2 转基因及转基因阳性植株筛选
2.1.3 突变体的筛选与鉴定
2.1.4 Chop-PCR检测idm3突变体的甲基化程度
2.2 结果与讨论
2.2.1 转基因个体及成功敲除个体的筛选
2.2.2 IDM3促进拟南芥的去甲基化过程
2.3 小结
3 运用CRISPR /CAS9系统通过基因组长片段删除敲除单个基因
3.1 材料与方法
3.1.1 用于长片段删除的sg RNAs设计与表达载体组装
3.1.2 转基因及转基因阳性植株的筛选
3.1.3 CRISPR/Cas9系统介导的拟南芥基因组长片段删除
3.2 结果与讨论
3.2.1 T1代AFLP检测筛选及测序结果
3.2.2 T2代大片段删除检测及稳定株系的获得
3.3 小结
4 拟南芥PYL基因家族多基因敲除突变体库的构建与基因功能初步研究
4.1 材料与方法
4.1.1 拟南芥PYLs多基因敲除sg RNA设计与表达载体组装
4.1.2 转化植株及PYLs多基因突变体库筛选方法
4.2 结果与讨论
4.2.1 转基因及多基因敲除个体的筛选
4.2.2 T2纯合多基因突变体的获得及表型和基因功能初步分析
4.3 小结
5 CRISPR/CAS9系统的广适性验证
5.1 材料与方法
5.1.1 用于番茄基因敲除的sg RNA设计与表达载体组装
5.1.2 番茄组织培养转化与诱导成苗
5.2 结果与讨论
5.2.1 转基因个体及成功敲除个体的筛选
5.3 小结
6 总结与展望
7 创新点
致谢
参考文献
附录1
A. 博士期间发表及待发表的文章
附录2
A. 文中涉及关键基因或原件的序列
B. 文中所用部分引物
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA甲基化与基因表达调控研究进展[J]. 史玉杰,李庆贺,刘晓辉. 中国生物工程杂志. 2013(07)
[2]RNAi机制及在植物中应用的研究概述[J]. 崔喜艳,孙小杰,刘忠野,张继伟. 吉林农业大学学报. 2013(02)
[3]水稻功能基因图位克隆研究进展[J]. 童继平,刘学军,韩傲男,马忠友,刘敏. 中国生物工程杂志. 2012(03)
[4]我国转基因植物研发形势及发展战略[J]. 万建民. 生命科学. 2011(02)
[5]植物RNAi的特点及其应用研究进展[J]. 白描,杨国顺,陈石,张美玲. 生物技术通报. 2009(08)
[6]反向遗传学在现代生物学领域中的应用[J]. 杨宇,王丹,李浩戈. 生物技术通报. 2009(05)
[7]功能基因组学的研究内容与方法[J]. 赵剑华,王秀琴,刘芝华,吴. 生物化学与生物物理进展. 2000(01)
本文编号：3008477
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/jckxbs/3008477.html
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