蛋白激酶OST1调控拟南芥响应低温胁迫的分子机制

发布时间：2017-04-12 23:00

  本文关键词：蛋白激酶OST1调控拟南芥响应低温胁迫的分子机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生长在自然界中的植物经常会受到低温影响。作为主要的外界环境因子,低温影响植物的生长、发育以及地理分布。经过长期进化,植物已经拥有一套复杂而精细的机制抵抗低温伤害。当植物感受低温信号以后,一系列冷响应基因COR被激活,其编码产物调节植物体内的生理生化状态,从而增强植物对低温的抵抗能力。目前,关于低温信号的研究,较为清楚的是ICE1-CBF调控网络。在这个信号途径中,低温能迅速诱导转录因子CBFs基因的表达,从而激活其下游靶基因COR的表达,增强植物的抗冻能力。CBFs基因受到上游一些转录因子的直接调控,其中包括ICE1和CAMATA3等正调控因子。ICE1是CBFs上游关键的bHLH类转录因子,它受多种蛋白翻译后修饰的调控。ICE1可以被E3泛素连接酶HOS1泛素化降解；同时还受到E3连接酶SIZ1蛋白的SUMO化稳定。所以,ICEl蛋白翻译后修饰是一个非常重要并且复杂的过程。蛋白磷酸化在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用,而泛素化及SUMO化通常与磷酸化密切相关,但在低温信号中有关蛋白激酶的研究非常少,目前不清楚哪些蛋白激酶参与CBF信号途径。 本论文通过筛选蛋白激酶突变体,获得一个冻敏感突变体ost1(open stomatal1)。 OST1/SnRK2.6/SnRK2E是拟南芥中一类特异调节植物气孔运动的Ser/Thr蛋白激酶,属于SnRK2s蛋白激酶家族。在拟南芥中,SnRK2s共有10个成员(SnRK2.1-SnRK2.10)。SnRK2.6与SnRK2.2和SnRK2.3相似性最高,功能存在冗余。在ABA信号途径中,OST1蛋白激酶活性受到PP2Cs蛋白磷酸酶的调控。在低浓度ABA条件下,PP2Cs通过与OST1相互作用抑制其活性；当ABA达到一定浓度以后,ABA通过与其受体PCARs结合,结合ABA的受体构象改变从而抑制PP2Cs活性,释放OST1,激活状态的OST1通过磷酸化转录因子AREBs/ABFs,从而激活ABA信号。另外,OST1可以磷酸化阴离子通道SLAC1,调节ABA介导的气孔关闭。本论文发现,ostl功能缺失突变体ostl-3和ostl-4均表现冻敏感表型,其体内CBFs及其下游COR基因的本底水平及低温诱导表达水平均低于野生型。过表达OST1能回复ostl突变体冻敏感表型。相反,OST1过表达株系则表现出明显的抗冻表型,CBFs及其下游COR基因的本底水平及低温诱导表达都明显高于野生型。以上结果说明,OST1作用于CBFs上游,正调控植物的抗冻性。 有意思的是,低温能够快速(0.5h)激活植物体内OST1蛋白激酶活性。在ABA合成缺陷突变体aba2-21中,OST1的激活程度与野生型类似。外源施加ABA合成抑制剂去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid, NDGA)不能抑制aba2-21中低温对OST1的激活。本论文还发现,在OST1被低温激活的时间范围内,植物体内ABA含量没有增加,反而呈下降趋势。这些结果暗示低温对OST1的激活不依赖于ABA含量。在ABA信号中,OST1蛋白激酶活性受到PP2C蛋白磷酸酶ABI1/2等调控。本论文结果显示,在abil-1(C)功能获得型突变体中,低温不能激活OST1。同时,abil-1(C)功能获得型突变体和ABIl过表达植株均表现冻敏感表型,而abil abi2habl功能缺失突变体则表现抗冻表型。与之相一致的是,abil-1(C)功能获得型突变体和ABIl过表达植株中的CBFs基因表达均低于野生型。这些结果说明,OST1激酶活性受低温激活,ABl1通过抑制这一过程负调控植物的抗冻性。 通过酵母双杂交的方法,本论文发现OST1与ICE1蛋白在酵母细胞中发生相互作用。Pull-down实验验证OST1与ICE1在体外发生直接相互作用。免疫共沉淀以及双分子荧光互补实验进一步证明OST1与ICEI在植物体内存在于同一个蛋白复合体中。进一步实验表明：激活状态的OST1能够磷酸化ICE1,从而增强ICE1的转录活性和蛋白稳定性。低温能增强ICE1蛋白体内磷酸化的程度。在ost1突变体中,由低温诱导的ICEI蛋白磷酸化程度减弱,说明低温下ICE1蛋白的磷酸化主要由OST1蛋白介导。通过氨基酸序列和点突变分析发现,OST1蛋白磷酸化ICE1蛋白的Ser278残在。当将ICE1蛋白Ser278突变成Asp278(模拟磷酸化形式,ICE1S278D)后,ICES278D的稳定性明显增强,同时ICES278D与HOS1蛋白的互作强度减弱。当将ICE1的Ser278突变成Ala278(模拟非磷酸化形式,ICE1S278A)后转入ice1-2突变体中，，ice1-22冻敏感表型不能被回复。这些结果说明Ser278的磷酸化是ICE1蛋白行使功能所必需的。遗传分析证明,)stl ice1双突变体表现冻敏感表型,过表达ICE1能回复ost1突变体冻敏感表型。 另外,本研究还发现,OST1能与HOS1蛋白互作，并且竞争性地干扰HOS1与ICE1蛋白的互作,从而稳定ICE1蛋白。 综合以上结果,OST1是植物响应低温过程中的重要蛋白激酶。低温快速激活OST1,激活状态的OST1磷酸化ICE1蛋白Ser278残基,从而增强ICE1蛋白的转录活性和稳定性；同时,OST1还可以与HOS1互作,干扰HOS1与ICE1之间的相互作用,起到稳定ICE1蛋白的作用。OST1通过以上机制稳定ICE1蛋白,正调节CBFs的表达,从而正调控植物对低温的应答。本研究为阐明植物响应低温胁迫的分子机理提供了新的理论依据。
【关键词】：蛋白激酶OST1 ICE1 HOS1 冷胁迫 拟南芥
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q945.78
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• ~.略词表12-15
• 第一章 文献综述15-42
• 1.1 低温对植物的影响15-17
• 1.1.1 冷害对植物的影响15-16
• 1.1.2 冻害对植物的影响16-17
• 1.2 植物抵抗低温的生理基础17-19
• 1.3 植物感受低温的机制19-22
• 1.3.1 细胞膜流动性的改变19
• 1.3.2 Ca~(2+)浓度变化及Ca~(2+)通道19-21
• 1.3.3 组氨酸蛋白激酶21-22
• 1.4 低温信号转导途径22-26
• 1.4.1 CBFs基因概述22-23
• 1.4.2 CBF信号途径中转录水平调控23-24
• 1.4.3 CBF信号途径中蛋白翻译后的修饰调控24-25
• 1.4.4 低温信号途径中的转录后修饰调控25-26
• 1.4.5 不依赖CBF信号途径26
• 1.5 脱落酸(ABA)研究进展26-40
• 1.5.1 ABA的合成26-27
• 1.5.2 ABA信号途径27-37
• 1.5.3 ABA与低温的关系37-38
• 1.5.4 其它激素与低温的关系38-40
• 1.6 本研究的目的和意义40-42
• 第二章 实验材料与方法42-67
• 2.1 实验材料42-44
• 2.1.1 植物材料42
• 2.1.2 主要菌株42
• 2.1.3 主要载体42-43
• 2.1.4 主要载体的构建方法43-44
• 2.2 实验所用的各种酶和试剂44-45
• 2.3 常用培养基和试剂的配制45-52
• 2.3.1 常用培养基的配制45-46
• 2.3.2 感受态制备时溶液配制46
• 2.3.3 抗生素贮存液配制46-47
• 2.3.4 拟南芥原生质体转化试剂47
• 2.3.5 DNA提取及鉴定试剂47-48
• 2.3.6 蛋白提取缓冲液48
• 2.3.7 蛋白染色和脱色液48
• 2.3.8 蛋白质免疫印迹实验相关试剂48-49
• 2.3.9 原核蛋白纯化试剂49
• 2.3.10 体外磷酸化缓冲液(20μL)49
• 2.3.11 胶内磷酸化(In-gel)缓冲液49-50
• 2.3.12 农杆菌注射烟草表达蛋白缓冲液50-51
• 2.3.13 ChIP实验相关试剂51-52
• 2.4 主要实验仪器52-53
• 2.5 实验方法53-67
• 2.5.1 植物生长条件53
• 2.5.2 拟南芥基因组DNA提取53-54
• 2.5.3 拟南芥基因组RNA提取54
• 2.5.4 拟南芥总蛋白提取54
• 2.5.5 试剂盒小量提取质粒54-55
• 2.5.6 试剂盒大量提取质粒55-56
• 2.5.7 普通PCR扩增56
• 2.5.8 高保真PCR扩增56-57
• 2.5.9 反转录合成CDNA57
• 2.5.10 实时定量PCR(Real-time PCR)57
• 2.5.11 PCR产物或者酶切产物回收57-58
• 2.5.12 大肠杆菌感受态细胞制备58
• 2.5.13 农杆菌感受态细胞制备58
• 2.5.14 DNA连接及质粒转化58-59
• 2.5.15 质粒电击转化(用于农杆菌转化)59
• 2.5.16 酵母细胞转化59
• 2.5.17 原核蛋白诱导59-60
• 2.5.18 原核蛋白纯化60-61
• 2.5.19 蛋白质免疫印迹(western blot)61
• 2.5.20 原生质体转化61-62
• 2.5.21 烟草叶片表达蛋白62
• 2.5.22 蛋白质免疫共沉淀62
• 2.5.23 Pull-down实验62-63
• 2.5.24 凝胶阻滞实验(EMSA)63
• 2.5.25 染色质免疫共沉淀(ChIP)63-64
• 2.5.26 体外磷酸化64-65
• 2.5.27 胶内磷酸化(In-gel)实验65
• 2.5.28 拟南芥冻处理实验65
• 2.5.29 离子渗漏率测定65
• 2.5.30 GUS活性测定65-66
• 2.5.31 转基因株系的获得方法66
• 2.5.32 DNA的定点突变66
• 2.5.33 碱性磷酸酶(CIAP)处理实验66-67
• 第三章 实验结果与分析67-101
• 3.1 OST1基因缺失导致植物抗冻能力降低67-69
• 3.2 OST1基因回复ost1-3突变体冻敏感表型69-70
• 3.3 OST1过表达植株表现抗冻表型70-71
• 3.4 OST1调节CBFs及其下游COR基因的表达71-73
• 3.5 OST1蛋白激酶活性受低温诱导激活73-80
• 3.5.1 低温不改变OST1蛋白的含量和定位73-74
• 3.5.2 低温激活OST1蛋白的激酶活性74-75
• 3.5.3 低温激活OST1蛋白的激酶不依赖ABA含量75-76
• 3.5.4 蛋白磷酸酶ABI1抑制OST1的低温激活76-77
• 3.5.5 ABI1负调控植物的低温响应77-80
• 3.6 OST1蛋白与ICE1蛋白发生相互作用80-84
• 3.6.1 OST1与ICE1在体外直接发生相互作用80-82
• 3.6.2 ICE1与SnRK2.3互作,与SnRK2.4没有相互作用82
• 3.6.3 OST1与ICE1在植物体内存在于同一个蛋白复合体上82-84
• 3.7 OST1磷酸化ICE1蛋白84-85
• 3.7.1 OST1体外直接磷酸化ICE184
• 3.7.2 低温增强ICE1蛋白的体内磷酸化程度并且依赖于OST1蛋白84-85
• 3.8 ICE1蛋白Ser278的磷酸化是其发挥功能必需的85-89
• 3.8.1 ICE1蛋白Ser278是OST1磷酸化ICE1的直接靶位点85-86
• 3.8.2 ICE1蛋白Ser278的磷酸化是其发挥功能必需的86-89
• 3.9 OST1增强ICE1蛋白的稳定性89-92
• 3.9.1 低温处理早期时的ICE1蛋白相对稳定89
• 3.9.2 OST1增强ICE1蛋白的稳定性89-91
• 3.9.3 ICE1蛋白的磷酸化是其蛋白稳定必须的91-92
• 3.10 OST1增强ICE1蛋白的转录活性92-94
• 3.11 OST1与HOS1存在相互作用94-95
• 3.12 OST1干扰HOS1与ICE1的相互作用95-98
• 3.12.1 OST1干扰HOS1与ICE1的相互作用95-97
• 3.12.2 磷酸化形式的ICE1与HOS1的互作强度减弱97-98
• 3.13 OST1与ICE1的遗传关系分析98-101
• 3.13.1 ost1与ice1的双突变体表现冻敏感表型98
• 3.13.2 过表达ICE1回复ost1冻敏感表型98-101
• 第四章 讨论与展望101-106
• 4.1 低温条件下OST1蛋白激酶活性的调控101-103
• 4.2 低温增强OST1介导的ICE1的磷酸化103-104
• 4.3 气孔与植物响应低温的关系104-106
• 第五章 结论106-107
• 参考文献107-127
• 附录127-129
• 致谢129-131
• 个人简介131

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 ;ROP11 GTPase is a Negative Regulator of Multiple ABA Responses in Arabidopsis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年03期

2 Viswanathan Chinnusamy;Ray Bressan;;ROP11 GTPase Negatively Regulates ABA Signaling by Protecting ABI1 Phosphatase Activity from Inhibition by the ABA Receptor RCAR1/PYL9 in Arabidopsis[J];Journal of Integrative Plant Biology;2012年03期

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本文编号：302224