干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究

发布时间：2017-04-13 18:19

  本文关键词：干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文研究了17株干酪乳杆菌和15株植物乳杆菌对11种抗生素的耐药性,通过MIC值的测定并对20个相关抗性基因的检测发现植物乳杆菌对链霉素的耐药性变化范围较大,从16 μg/mL(?)512μg/mL,且植物乳杆菌IMAU60045和IMAU80091均携带有链霉素相关抗性基因aadA和ant(6),但对链霉素表现出不同的耐药性,分别为16和256 μg/mL。将低抗链霉素耐药性植物乳杆菌IMAU60045在含有链霉素浓度递增的LSM培养基中连续传代30天进行高抗链霉素IMAU60045的构建,IMAU60045的耐药性由16μg/mL增加至16384μg/mL,耐药性增加了1024倍。通过qPCR研究抗性基因aadA和ant(6)表达量的变化发现随着传代时间增加MAU60045中aadA和ant(6)的相对基因表达量逐渐增加,且传代过程中前15天增加幅度高于后15天,传代结束时高抗链霉素IMAU60045的aadA相对基因表达量是原始菌株的3.35倍,且比ant(6)的相对基因表达量增加快,传代结束后aadA和ant(6)的相对基因表达量分别增加了0.702和0.337,说明长期受到含有链霉素的胁迫可引起与链霉素抗性相关基因相对表达量的增加。为深入研究乳杆菌的耐药性及适应性分子机制,以一株经过系统研究的益生菌干酪乳杆菌Zhang为研究对象,采用实验室进化的研究方法将其接种至含有恒定浓度的单阿莫西林或庆大霉素及2者混合的LSM培养基中连续传代2000代,并以不含抗生素的培养基传代菌株作为对照,每隔200代取样进行基因组重测序,同时测定其耐药性、活菌数和OD值的变化以分析干酪乳杆菌Zhang在传代过程中表型和基因型的变化。通过该进化实验研究阿莫西林和庆大霉素对干酪乳杆菌Zhang的作用机制以及干酪乳杆菌Zhang对该2种抗生素耐药性增加的机理。经研究发现,在含有单一阿莫西林或庆大霉素及2者混合的LSM培养基中连续传代的菌株耐药性缓慢增加并分别在600、1200和1200代时开始保持恒定。同时,在植物乳杆菌IMAU60045和干酪乳杆菌Zhang的传代研究中均发现了同类抗生素交叉耐药性的现象,在链霉素培养基中传代的IMAU60045和庆大霉素中传代的干酪乳杆菌Zhang随着传代数增加,对其他氨基糖苷类抗生素的耐药性均有不同程度增加,在阿莫西林培养基中传代的干酪乳杆菌Zhang则对同属β-内酰胺类的氨苄西林表现出更高的耐药性。通过对各代数不同培养基传代的干酪乳杆菌Zhang的3个谱系基因突变(SNPs, InDels和SV)的检测,发现阿莫西林和庆大霉素分别对干酪乳杆菌Zhang细胞壁合成与细胞的转录和翻译有较大的影响。本研究发现在LSM-A中传代的菌株形态呈现长的细丝状,且LSM-A中传代菌株中检测出与较大分子量青霉素结合蛋白相关的基因mrcA, pbpA, pbpB发生了突变。青霉素结合蛋白与细菌形态有直接联系,并对细菌生长和繁殖有重要影响。在传代过程中,由不同抗生素培养基中传代的各谱系活菌数的变化可发现,LSM-A中传代的3个谱系活菌数始终保持相对较低的水平,而LSM-G中传代的干酪乳杆菌Zhang则随着传代的进行,活菌数和OD值都与对照菌株逐渐接近,说明不同抗生素对干酪乳杆菌Zhang的作用机制不同,使其在进化过程中出现不同的适应性。基因组重测序分析显示,在不同培养基传代的各代干酪乳杆菌Zhang基因组中检测出抗生素钝化酶、细胞膜转运蛋白、修复蛋白和信号转导等与抗生素耐药性相关的基因突变,这些基因突变对干酪乳杆菌Zhang改变抗生素作用靶位点、转运并外排抗生素、改变细胞膜通透性、钝化和改变抗生素结构、调控抗药基因的表达并维持正常能量代谢有重要的作用。本研究通过对干酪乳杆菌Zhang在恒定浓度的常见抗生素阿莫西林和庆大霉素培养基中连续传代的实验室进化研究以及不同代数干酪乳杆菌Zhang各谱系基因组重测序的数据分析显示,干酪乳杆菌Zhang在长期进化过程中对阿莫西林和庆大霉素的耐药性仅分别增加4倍和8倍,同时在更长时间的传代进化过程中保持恒定不变,不会出现与致病菌类似、耐药性极强的“超级菌株”。本研究中检测出的与干酪乳杆菌Zhang耐药性增强的直接或间接相关的基因突变均未发生在转座区域或者质粒中,这也进一步说明干酪乳杆菌Zhang是一株安全的益生菌。
【关键词】：乳杆菌 最小抑制浓度 抗性基因 基因表达 进化 全基因组重测序 耐药机制
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-15
• 缩略语表15-16
• 1 引言16-33
• 1.1 益生菌16-17
• 1.1.1 乳杆菌属16-17
• 1.1.2 干酪乳杆菌Zhang17
• 1.2 抗生素17-30
• 1.2.1 抗生素的分类17-21
• 1.2.2 细菌耐药性的出现21-22
• 1.2.3 细菌抗性基因的转移22-23
• 1.2.4 乳酸菌耐药性的研究23-27
• 1.2.5 乳酸菌耐药性的检测27-30
• 1.3 细菌进化的研究30-32
• 1.3.1 细菌在含有抗生素环境中的进化31-32
• 1.3.2 基因组重测序32
• 1.4 主要研究内容及实验目的和意义32-33
• 2 材料与方法33-50
• 2.1 菌株来源33-34
• 2.2 主要试剂34
• 2.3 主要设备34-35
• 2.4 实验方法35-50
• 2.4.1 干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药性的研究35-39
• 2.4.2 干酪乳杆菌和植物乳杆菌抗性基因的检测39-41
• 2.4.3 植物乳杆菌IMAU60045链霉素抗性基因的初步鉴定41-43
• 2.4.4 干酪乳杆菌Zhang在含有抗生素的培养基中连续传代的研究43-49
• 2.4.5 数据分析49-50
• 3 结果与分析50-136
• 3.1 干酪乳杆菌和植物乳杆菌抗生素耐药性50-55
• 3.2 干酪乳杆菌和植物乳杆菌抗性基因的检测55-58
• 3.3 植物乳杆菌IMAU60045链霉素抗性基因的初步鉴定58-60
• 3.4 干酪乳杆菌Zhang在含有抗生素的培养基中的连续传代60-68
• 3.4.1 干酪乳杆菌Zhang的生长曲线和代数计算60-62
• 3.4.2 干酪乳杆菌Zhang在抗生素环境中传代过程中MIC的变化62-65
• 3.4.3 干酪乳杆菌Zhang在去抗生素选择压力培养基的传代65
• 3.4.4 干酪乳杆菌Zhang对β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素耐药性的变化65-66
• 3.4.5 干酪乳杆菌Zhang在传代过程中活菌数和OD值的变化66-68
• 3.5 干酪乳杆菌Zhang传代过程中各谱系基因组重测序68-123
• 3.5.1 基因组重测序样品DNA的质量控制69-73
• 3.5.2 样品纯度的检测73-77
• 3.5.3 干酪乳杆菌Zhang基因组重测序数据预处理77-86
• 3.5.4 各代不同传代环境干酪乳杆菌Zhang基因组中基因突变检测86-118
• 3.5.5 干酪乳杆菌Zhang质粒中基因突变的检测118
• 3.5.6 突变基因产物直系同源簇和代谢通路的分析118-123
• 3.6 干酪乳杆菌Zhang对阿莫西林和庆大霉素耐药性增强机理的研究123-136
• 3.6.1 传代过程中干酪乳杆菌Zhang对阿莫西林耐药性增强机理研究124-132
• 3.6.2 传代过程中干酪乳杆菌Zhang对庆大霉素耐药性增强机理研究132-134
• 3.6.3 其他耐药机理134-136
• 4 讨论136-139
• 致谢139-140
• 参考文献140-156
• 作者简介156-157

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈小龙;胡永恒;周斌;;产nisin基因工程菌的构建与应用[J];发酵科技通讯;2015年03期

2 李宏波;赵立斌;;二元信号系统的研究进展[J];河北医药;2015年08期

3 姚丰华;张钰;朱国强;;沙门菌Ⅵ型分泌系统研究进展[J];中国预防兽医学报;2014年06期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 蔡霞;PhoP-PhoQ双组分信号转导系统调控福氏志贺菌毒力的机理研究[D];复旦大学;2011年

2 姚丰华;肠炎沙门菌溶血素共调节蛋白hcp基因及其致病性相关研究[D];扬州大学;2014年

3 陈臣;植物乳杆菌ST-Ⅲ全基因组序列分析及其对低聚果糖代谢通路的解析[D];江南大学;2014年

  本文关键词：干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304200