HBx与COXIII共定位上调HepG2细胞线粒体功能促进细胞增殖

发布时间：2017-04-14 20:24

  本文关键词：HBx与COXIII共定位上调HepG2细胞线粒体功能促进细胞增殖，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景和目的:乙肝病毒x蛋白(HBx)被称为“病毒癌蛋白(viral oncoprotein)”,它促进了乙型肝炎病毒(HBV)相关的肝细胞癌的发展,但其确切机制未明。我们前期通过酵母双杂交、交配以及免疫共沉淀实验首次证实了线粒体内膜蛋白细胞色素C氧化酶亚单位III(COXIII)是HBx的体内结合蛋白。本研究将进一步探讨HBx与COXIII在线粒体中共定位及其对线粒体超微结构与功能的影响,探索HBx对HepG2细胞增殖能力的影响。方法:首先构建稳定表达HBx的肝癌细胞株HepG2/HBx,并以空载对照组HepG2/mock、空白对照组HepG2作为实验对照,利用激光共聚焦显微镜观察HBx与COXIII在线粒体中的定位。接着通过RT-PCR与Western blot法检测COXIII的mRNA与蛋白表达水平,酶动力学方法检测线粒体细胞色素C氧化酶(COX)的活性,流式细胞仪测量细胞内ROS和线粒体跨膜电位的水平,扫描电镜下观察HepG2/HBx细胞线粒体超微结构的改变。然后利用RT-PCR与Western blot法检测环氧合酶-2(COX-2)的mRNA与蛋白表达水平,加入ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后再检测COX-2的表达水平改变。采用CCK-8法和克隆形成试验检测细胞的增殖能力,接着加入COX-2的抑制剂NS-398后再次检测细胞的增殖能力改变情况。最后通过RT-PCR与Western blot法检测β catenin的mRNA与蛋白表达水平,RT-PCR法检测β catenin下游靶基因cyclin-D1以及c-myc的mRNA表达水平,并加入COX-2的抑制剂NS-398后观察HepG2/HBx细胞株β catenin蛋白表达水平改变,再加入β catenin的抑制剂XAV939后CCK-8法检测细胞增殖能力的改变。结果:成功构建稳定表达HBx的肝癌细胞株HepG2/HBx,激光共聚焦显微镜观察到HBx与COXIII在线粒体中共定位。HBx上调HepG2细胞COXIII转录后水平,增高COX酶活性、ROS水平以及线粒体跨膜电位。扫描电镜下观察到HepG2/HBx细胞线粒体稍肿胀。另外,HBx上调HepG2细胞COX-2的mRNA与蛋白表达水平,当加入ROS的清除剂NAC后,COX-2的蛋白表达水平下降。HepG2/HBx增殖能力增强,克隆形成率增高,当加入COX-2的抑制剂NS-398后,HepG2/HBx细胞的增殖能力下降。最后,我们检测到HBx能够上调HepG2细胞β catenin的mRNA与蛋白表达水平,以及β catenin下游靶基因cyclin-D1和c-myc的mRNA表达水平,加入COX-2的抑制剂NS-398后HepG2/HBx细胞株β catenin蛋白表达水平下调,而当加入β catenin的抑制剂XAV939后,HepG2/HBx细胞的增殖能力下降。结论:稳定表达的HBx能够与COXIII在HepG2细胞线粒体中共定位,上调线粒体的功能,增加ROS的水平来提高COX-2的表达,进一步上调β catenin的表达水平从而促进细胞的增殖。
【关键词】：乙肝病毒x蛋白 细胞色素C氧化酶亚单位III 活性氧 环氧合酶-2 细胞增殖
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R373.21
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-13
• 第一部分 稳定表达HBx的肝癌细胞株的构建与鉴定13-25
• 一 引言13
• 二 实验材料与实验仪器13-14
• 三 实验步骤14-22
• 四 实验结果22-25
• 第二部分 HBx与COXIII在Hep G2 细胞中共定位及其对线粒体结构与功能的影响25-40
• 一 引言25-26
• 二 实验材料与实验仪器26-27
• 三 实验步骤27-32
• 四 实验结果32-38
• 五 讨论38-40
• 第三部分 HBx通过上调ROS水平增加COX-2 的表达促进了Hep G2细胞的增殖40-58
• 一 引言40
• 二 实验材料与实验仪器40-42
• 三 实验步骤42-47
• 四 实验结果47-56
• 五 讨论56-58
• 第四部分 HBx通过上调COX-2 水平激活β-catenin信号转导通路促进了Hep G2 细胞的增殖58-73
• 一 引言58
• 二 实验材料与实验仪器58-59
• 三 实验步骤59-64
• 四 实验结果64-71
• 五 讨论71-73
• 结论73-74
• 参考文献74-82
• 综述82-96
• 参考文献89-96
• 致谢96

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 余桂芳;严跃红;王瑞鑫;李显波;曾文铤;朱科伦;;慢病毒介导HBV X基因稳定表达HepG2细胞系的建立[J];世界华人消化杂志;2012年08期

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本文编号：306803