Ⅱ型NADH脱氢酶NDH2的结构与功能研究

发布时间：2017-04-14 22:16

  本文关键词：Ⅱ型NADH脱氢酶NDH2的结构与功能研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：由单亚基组成的II型NADH脱氢酶(简称为NDH2)是呼吸链上多亚基的复合物I(I型NADH脱氢酶,NDH-1,又称为NADH:辅酶Q氧化还原酶)的可替代蛋白,两者在线粒体电子传递链上参与催化电子从NADH传递到辅酶Q。酵母的NDH2(Ndi1)蛋白存在于线粒体基质膜内侧,对于维持线粒体NADH/NAD+的动态平衡至关重要;它还可以用于由复合物I缺陷引起的人类疾病的基因治疗中。此外,NDH2存在于低等生物中,尤其是在病原微生物中广泛存在,并且在人体内并无它的同源蛋白,因此,它是一种非常好的药物靶点。通过蛋白质体外表达、纯化和X-射线晶体学的研究,我们解析了世界上第一个NDH2蛋白——Ndi1的2.39埃高分辨晶体结构,以及Ndi1与辅酶Q(2.48埃)、N ADH(2.26埃)和N ADH-辅酶Q(2.52埃)的底物复合物结构;在所有的结构中,Ndi1都是同源二聚体。通过序列分析发现,NDH2蛋白家族存在一个保守的C端结构域,该结构域在介导蛋白质的二聚化、膜锚定以及底物的识别中发挥着重要作用;相关的生化和细胞生物学实验也证明了这一观点。通过解析Ndi1蛋白与底物结合的复合物结构,结合电子顺磁共振实验,我们对呼吸链上电子传递的机制有了更加深入的了解。由于NDH2蛋白存在于多种病原微生物中,是一个良好的药物靶点,我们还在体外摸索了7种其他物种NDH2的表达纯化条件,并对其进行了晶体学分析,以及分子化合物库的筛选,最终得到了一些有良好抑制作用的化合物分子,这些工作将对于针对致病微生物的药物开发和设计有很好的帮助。本文综合使用X-射线晶体衍射方法、生物化学、细胞生物学、药物化学、物理学等多种手段,全面系统的研究了最具有代表性的酵母Ndi1的蛋白结构、功能,以及其电子传递的可能机制。同时,对于多种病原微生物N DH2蛋白的研究,不仅加强了我们对N DH2家族结构的了解,也对后期抑制剂分子的筛选与优化,以及药物的设计提供理论依据。
【关键词】：电子传递链 NDH2 药物靶点 病原微生物
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q55
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符号对照表9-11
• 第1章 引言11-34
• 1.1 电子传递链11-13
• 1.1.1 真核生物的电子传递链11-12
• 1.1.2 原核生物的电子传递链12-13
• 1.2 N ADH脱氢酶及其分类13-15
• 1.2.1 复合物I13-14
• 1.2.2 N qr14
• 1.2.3 N DH214-15
• 1.3 N DH2的研究现状15-18
• 1.3.1 N DH2的分类15-16
• 1.3.2 N DH2的生理意义16-17
• 1.3.3 N DH2蛋白结构的研究17-18
• 1.4 酵母的N DH2蛋白——N di118-22
• 1.4.1 N di1作为基因治疗手段18-20
• 1.4.2 N di1的酶反应机制20-22
• 1.5 病原微生物与N DH222-24
• 1.6 肺结核及结核分枝杆菌24-29
• 1.6.1 肺结核现状24-27
• 1.6.2 结核分枝杆菌27
• 1.6.3 抗结核药物及其靶点27-29
• 1.7 结核分枝杆菌呼吸链及其N DH229-33
• 1.7.1 结核分枝杆菌的呼吸链29-30
• 1.7.2 Mtb N DH2是无氧条件下起始呼吸链的关键蛋白30-31
• 1.7.3 Mtb N DH2与异烟肼和乙醇胺耐受有关31-32
• 1.7.4 Mtb N DH2抑制剂有抗TB作用32-33
• 1.8 潜在药物靶点—— N DH233-34
• 第2章 实验材料与方法34-58
• 2.1 实验仪器34-36
• 2.2 实验试剂36-43
• 2.2.1 实验用菌株36-37
• 2.2.2 基因及菌株获取途径37
• 2.2.3 表达载体的选择37-38
• 2.2.4 实验常用培基38-41
• 2.2.5 常用储液及缓冲液41-43
• 2.2.6 常用试剂盒43
• 2.3 实验方法43-58
• 2.3.1 分子克隆43-46
• 2.3.2 蛋白表达46-47
• 2.3.3 蛋白纯化47-50
• 2.3.4 蛋白结晶及优化50-52
• 2.3.5 蛋白与底物复合物的结晶52
• 2.3.6 数据收集及相位问题52-54
• 2.3.7 酶活测定54-55
• 2.3.8 酵母实验55-56
• 2.3.9 电子顺磁共振实验56-57
• 2.3.10结核分枝杆菌生长抑制实验57-58
• 第3章 酵母Ndi1蛋白的纯化及结晶58-76
• 3.1 本章引论58
• 3.2 蛋白的基本信息分析58-60
• 3.3 蛋白的表达纯化60-65
• 3.3.1 克隆构建60
• 3.3.2 蛋白的表达60-61
• 3.3.3 蛋白的纯化61-63
• 3.3.4 突变体蛋白的纯化63-65
• 3.4 N di1蛋白晶体的筛选及优化65-73
• 3.4.1 晶体的初筛选尝试66-67
• 3.4.2 基于TritonX- 100分子的晶体筛选67-69
• 3.4.3 N di1蛋白晶体的优化69-72
• 3.4.4 N di1硒代蛋白晶体72
• 3.4.5 N di1蛋白与底物的复合物晶体72-73
• 3.5 衍射数据的收集和处理73-75
• 3.6 小结75-76
• 第4章 酵母Ndi1蛋白的结构与生化研究76-99
• 4.1 本章引论76
• 4.2 N di1蛋白的晶体结构76-92
• 4.2.1 N di1蛋白的整体结构76-78
• 4.2.2 TritonX- 100在蛋白中的结合位置78
• 4.2.3 高度保守的C端结构域78-79
• 4.2.4 C端结构域介导N di1蛋白的二聚化79-83
• 4.2.5 C端结构域介导N di1蛋白的膜锚定83-86
• 4.2.6 N di1蛋白及其底物86-92
• 4.3 N di1蛋白的电子传递机制92-98
• 4.3.1 N di1-N ADH-Q的复合物结构93-94
• 4.3.2 与Pdr- Pdx复合物的结构比对94-95
• 4.3.3 N di1蛋白中可能的电子传递路径95
• 4.3.4 电子顺磁共振实验检测半醌自由基95-96
• 4.3.5 功率饱和实验检测存在两种半醌自由基96-98
• 4.4 本章小结98-99
• 第5章 结核分枝杆菌及其他病原微生物NDH2的研究99-127
• 5.1 本章引论99
• 5.2 结核分枝杆菌N DH2的表达纯化99-108
• 5.2.1 二级结构预测及克隆构建99-100
• 5.2.2 蛋白表达100-102
• 5.2.3 蛋白纯化102-107
• 5.2.4 晶体的筛选107-108
• 5.3 体外药物筛选108-113
• 5.3.1 体外检测蛋白活性108-109
• 5.3.2 抑制剂筛选109-111
• 5.3.3 IC50检测111
• 5.3.4 结核分枝杆菌生长抑制实验111-113
• 5.4 其他物种N DH2的研究113-125
• 5.4.1 耻垢分枝杆菌N DH2114-116
• 5.4.2 无乳链球菌N DH2116-119
• 5.4.3 恶性疟原虫N DH2119-122
• 5.4.4 其他物种N DH2122-125
• 5.5 小结125-127
• 第6章 讨论与展望127-137
• 6.1 本章引论127
• 6.2 酵母N di1蛋白127-131
• 6.2.1 C端结构域127-129
• 6.2.2 N di1蛋白的电子传递129-131
• 6.3 Mtb等病原微生物N DH2蛋白的研究131-132
• 6.3.1 M.sm eg与Mtb N DH2蛋白131-132
• 6.3.2 其他病原微生物的N DH2蛋白132
• 6.4 展望132-137
• 6.4.1 N di1蛋白存在的问题133-134
• 6.4.2 病原微生物N DH2蛋白的结构134-135
• 6.4.3 病原微生物N DH2蛋白抑制剂的筛选与优化135-136
• 6.4.4 抑制剂的体内实验136-137
• 参考文献137-148
• 致谢148-151
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果151

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本文编号：306994