大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH结构与功能研究

发布时间：2017-04-15 04:08

  本文关键词：大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH结构与功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在生命活动过程中,细胞需要在环境中摄取营养物质,并且要把新陈代谢过程中产生的废物外排出去。这些都需要定位在细胞膜上的主动转运蛋白来完成。主动运输是指利用外来能量进行的底物跨膜运输,而底物的运动方向往往与自身浓度梯度相反,也就是将物质从低浓度一侧运输到高浓度一侧。根据能量来源的不同,膜转运蛋白主要划分为初级主动转运蛋白和次级主动转运蛋白。MFS超家族转运蛋白是最大的转运蛋白家族之一,属于次级转运蛋白。该家族成员主要利用膜两侧的质子、钠离子浓度梯度作为驱动力,将底物进行跨膜运输。EcYbgH是大肠杆菌中利用细胞膜两侧质子浓度梯度转运小肽的转运蛋白。其主要底物是C端具有携带正电荷的氨基酸残基的小肽。 我们解析了EcYbgH处于内向型构象的3.4A分辨率晶体结构,并利用细胞水平的转运实验研究了该蛋白的转运功能。在结构分析中,我们发现在细胞膜外侧在穿膜螺旋5-6之间的A类模体和保守的Asp44-Arg297盐桥,对于稳定内向型构象是非常关键的,而细胞膜内侧TM2/3之间的模体A则可以将蛋白稳定在外向型构象。这三个相互作用均发生于转运蛋白的两个跨膜结构域之间。当破坏三者中的一个或者两个,EcYbgH蛋白的转运活性就会丧失。而当把三者同时破坏,转运活性又得到恢复。因此,我们认为在MFS超家族蛋白转运过程中,存在一个内向型与外向型构象之间的能量平衡。而两者的失衡不利于转运蛋白的转运活性。同时,通过功能实验我们证明保守的Glu21是EcYbgH转运蛋白的质子化位点。另外,原核POTs转运蛋白亚家族成员氨基酸序列所特有的两根“嵌入”跨膜螺旋可能参与了对构象变化的调控。 除了对大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH进行了结构与功能的研究之外,我还参与了其它几个膜蛋白的工作包括YajR、CsgG、PgpB等,在这些工作中我主要负责数据处理、结构解析、修正以及分析。在处理这些工作的过程中,遇到了各种各样的困难,例如数据分辨率低,晶体衍射各向异性等。对于各向异性的数据,在数据处理的过程中一般使用ADS的软件包,将数据进行椭球形的截取,这样就可以去掉信噪比不高的数据。在修正的过程中,通常采用各种约束来保证修正过程的稳定,这些约束主要有二级结构约束、二面角约束、参考模型约束等。
【关键词】：次级转运蛋白 EcYbgH 模体A 能量平衡 质子化位点 嵌入螺旋
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-12
• 第1章 引言12-26
• 1.1 膜蛋白概述12-13
• 1.2 膜转运蛋白13-15
• 1.2.1 被动运输13-14
• 1.2.2 主动运输14-15
• 1.3 MFS家族研究现状15-19
• 1.3.1 MFS超家族蛋白分类15-16
• 1.3.2 MFS超家族结构生物学研究16-18
• 1.3.3 MFS超家族转运机制18-19
• 1.4 POT家族研究背景19-26
• 1.4.1 POTs家族保守motif19-20
• 1.4.2 人源POTs家族转运蛋白,PepT1和PepT220-21
• 1.4.3 POTs家族结构生物学研究21-22
• 1.4.4 大肠杆菌YbgH(EcYbgH)研究背景22-26
• 第2章 膜蛋白的结构生物学研究26-42
• 2.1 膜蛋白表达26-27
• 2.2 去污剂27-30
• 2.2.1 去污剂的分类27-28
• 2.2.2 去污剂在溶液中的性质28-29
• 2.2.3 去污剂在结构生物学中的应用29-30
• 2.3 晶体生长30-33
• 2.3.1 膜蛋白晶体堆积方式30-31
• 2.3.2 结晶方法31-32
• 2.3.3 提高膜蛋白稳定性32-33
• 2.4 重原子浸泡33-35
• 2.5 数据收集以及结构修正35-39
• 2.5.1 同步辐射设施发展35-36
• 2.5.2 数据收集、处理36-38
• 2.5.3 模型搭建以及结构修正策略38-39
• 2.6 展望39-42
• 第3章 实验原理与方法42-50
• 3.1 克隆构建42-43
• 3.1.1 双酶切构建42
• 3.1.2 不依赖于连接酶的构建42
• 3.1.3 点突变构建42-43
• 3.2 大肠杆菌系统膜蛋白表达43-44
• 3.3 破菌、蛋白纯化44-46
• 3.4 硒代晶体制备46-47
• 3.5 细胞水平的转运试验47
• 3.6 Western Blot检测膜蛋白表达水平47-50
• 第4章 大肠杆菌YbgH的克隆、表达和结晶50-58
• 4.1 EcYbgH基本信息50
• 4.2 EcYbgH的克隆,表达以及纯化条件摸索50-52
• 4.2.1 EcYbgH克隆、表达50-51
• 4.2.2 EcYbgH不同去污剂51-52
• 4.3 EcYbgH晶体筛选和优化52-58
• 4.3.1 晶体初步筛选52-54
• 4.3.2 晶体优化和重复54-55
• 4.3.3 重原子衍生物制备55-58
• 第5章 数据收集、结构解析以及修正58-66
• 5.1 晶体数据收集58
• 5.2 相位解析58-61
• 5.3 模型搭建以及修正61-63
• 5.4 EcYbgH晶体结构分析63-66
• 第6章 EcYbgH基于结构的功能研究66-76
• 6.1 质子化位点66-69
• 6.1.1 膜电位与转运蛋白66
• 6.1.2 质子化如何成为驱动力66-67
• 6.1.3 EcYbgH质子化位点67-69
• 6.2 Motif A69-73
• 6.2.1 Motif A的工作机制69-71
• 6.2.2 EcYbgH中的motif A71-73
• 6.3 V形插入螺旋73-75
• 6.3.1 motif A调控模型73-74
• 6.3.2 HAB的功能74-75
• 6.4 结论与展望75-76
• 第7章 CsgG结构与功能研究76-86
• 7.1 细菌与Curli76-77
• 7.2 大肠杆菌Curli的研究77-78
• 7.3 CsgG的克隆、表达、纯化以及长晶体78-79
• 7.4 CsgG结构解析及修正79-83
• 7.5 CsgG结构分析83-85
• 7.6 CsgG的功能研究85-86
• 第8章 参与的其它工作86-91
• 8.1 EcYajR的结构解析86-88
• 8.1.1 EcYajR研究背景86
• 8.1.2 EcYaJR结构解析、修正以及分析86-87
• 8.1.3 YAM结构域87-88
• 8.2 EcPgpB的结构解析88-90
• 8.2.1 EcPgpB研究背景88-89
• 8.2.2 EcPgpB晶体结构解析89-90
• 8.3 脂多糖合成相关复合物LptD/E90-91
• 参考文献91-100
• 附录1 实验仪器和材料100-102
• 附录2 E.coli MFS超家族转运蛋白motif A预测102-106
• 致谢106-108
• 在读期间发表的学术论文108

【共引文献】

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本文编号：307573