网格重链蛋白CHC2在百脉根结瘤信号途径中功能及作用机制的研究

发布时间：2021-05-06 09:22

　　豆科植物与根瘤菌之间共生固氮关系的建立,需要寄、宿主双方对对方信号的接受和反馈。豆科植物释放类黄酮,根瘤菌接受类黄酮信号之后诱导结瘤相关基因表达,并分泌结瘤因子;豆科植物在感知结瘤因子信号之后,开启信号转导网络,启动共生结瘤相关基因的表达,最终形成共生体—根瘤。百脉根中感知结瘤因子信号的是两个Lys M类受体激酶NFR1/NFR5,并向下游效应基因传递结瘤因子信号。尽管我们知道其下游的效应基因是SYMRK,但是如何传递的机制不清楚。研究表明ROP6与NFR5相互作用,并通过调节侵入线的发育正调控结瘤。本研用ROP6为诱饵蛋白,从百脉根AD-c DNA文库筛选与其相互作用蛋白来展开,主要结果如下:1.以ROP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交技术从百脉根AD-c DNA文库中筛选分离到网格重链蛋白CHC2,体外pull-down实验和烟草叶片双分子荧光互补实验进一步证实了ROP6与CHC2的相互作用。用生物信息学的方法分析CHC2的结构,并根据结构将CHC2截成9个不同大小区段,鉴定出与ROP6相互作用的结构域。2.克隆百脉根另一个CHC基因—CHC6以及几个百脉根小G蛋白,利用酵母双杂交实验... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：119 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
    1.1 共生固氮的概念及意义
    1.2 豆科植物与根瘤菌根瘤共生固氮体系
        1.2.1 根瘤菌与豆科植物
        1.2.2 根瘤的形成
    1.3 根瘤菌中参与的结瘤基因
    1.4 结瘤因子
    1.5 结瘤因子信号转导途径
        1.5.1 结瘤因子受体激酶
        1.5.2 结瘤因子信号转导途径
    1.6 小G蛋白
        1.6.1 小G蛋白的结构及调节机制
        1.6.2 小G蛋白的分类
        1.6.3 小G蛋白生物学功能
    1.7 网格蛋白
        1.7.1 网格重链蛋白
        1.7.2 网格轻链蛋白
        1.7.3 网格蛋白介导的胞吞作用机制
        1.7.4 网格蛋白的功能
        1.7.5 磷酸化调节网格蛋白介导的受体内吞
    1.8 本实验的研究目的和意义
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株
        2.1.3 质粒
        2.1.4 主要分子生物学试剂
        2.1.5 常用培养基配方
            2.1.5.1 大肠杆菌培养基
            2.1.5.2 酵母培养基
            2.1.5.3 根瘤菌培养基
            2.1.5.4 植物生长培养基
            2.1.5.5 毛根转化生根培养基
    2.2 材料
        2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
            2.2.1.1 培养基
            2.2.1.2 缓冲液
            2.2.1.3 感受态细胞的制备
            2.2.1.4 大肠杆菌转化
        2.2.2 农杆菌电转化感受态细胞的制备及转化
            2.2.2.1 培养基
            2.2.2.2 缓冲液
            2.2.2.3 农杆菌电转化感受态细胞的制备
            2.2.2.4 农杆菌电转化
        2.2.3 LiAc法酵母感受态细胞的制备及转化
            2.2.3.1 培养基
            2.2.3.2 缓冲液及试剂
            2.2.3.3 酵母感受态细胞的制备
            2.2.3.4 酵母转化
                2.2.3.4.1 小样转化体系
                2.2.3.4.2 酵母转化
        2.2.4 发根农杆菌介导的毛根转化
            2.2.4.1 培养基
            2.2.4.2 缓冲液及试剂
            2.2.4.3 毛根转化
                2.2.4.3.1 外植体的获得
                2.2.4.3.2 农杆菌准备
                2.2.4.3.3 侵染及诱导生根
            2.2.4.4 毛根鉴定
        2.2.5 双分子荧光互补（BiFc）实验
            2.2.5.1 原理及观察
            2.2.5.2 烟草叶片转化
                2.2.5.2.1 缓冲液及试剂
                2.2.5.2.2 烟草叶片转化
            2.2.5.3 烟草叶片总蛋白抽提
                2.2.5.3.1 缓冲液
                2.2.5.3.2 烟草叶片总蛋白抽提
        2.2.6 酵母双杂交实验
            2.2.6.1 原理
            2.2.6.2 酵母Mating
                2.2.6.2.1 培养基
                2.2.6.2.2 小样Mating
            2.2.6.3 β-半乳糖苷酶活性检测
                2.2.6.3.1 缓冲液及试剂
                2.2.6.3.2 β-半乳糖苷酶活性检测
                2.2.6.3.3 β-半乳糖苷酶活性测定
        2.2.7 标签融合蛋白质的原核表达及纯化
            2.2.7.1 缓冲液及试剂
            2.2.7.2 标签融合蛋白质原核表达
            2.2.7.3 His-Tag融合蛋白的纯化
            2.2.7.4 MBP-Tag融合蛋白的纯化
        2.2.8 蛋白质体外相互作用实验
            2.2.8.1 蛋白质体外Pull-down实验
            2.2.8.2 蛋白质体外竞争性实验
            2.2.8.3 Western-Blot
                2.2.8.3.1 缓冲液及试剂
                2.2.8.3.2 Western-Blot
        2.2.9 RNA操作
            2.2.9.1 根总RNA的抽提
            2.2.9.2 cDNA第一链合成
        2.2.10 毛根转化植株接种及结瘤结果统计
3 结果与分析
    3.1 百脉根网格重链蛋白
        3.1.1 百脉根网格重链蛋白的分离与鉴定
        3.1.2 百脉根网格重链蛋白的结构
        3.1.3 网格重链蛋白进化分析
    3.2 百脉根网格重链蛋白与ROP6 相互作用
        3.2.1 百脉根CHC2 与ROP6 相互作用结构域分析
        3.2.2 百脉根CHC2 与ROP6 体外相互作用
        3.2.3 CHC2 与ROP6 在烟草细胞相互作用
        3.2.4 百脉根CHC2 与ROP6 相互作用的特异性
            3.2.4.1 百脉根ROP6 与CHC2 特异性相互作用
            3.2.4.2 百脉根CHC2 与ROP6 特异性相互作用
    3.3 百脉根网格重链蛋白与CLCs相互作用
        3.3.1 百脉根CHC2 与CLCs相互作用
        3.3.2 百脉根CHC2 与CLC1 在烟草细胞相互作用
        3.3.3 CLC1 的磷酸化不影响与CHC2 的体外相互作用
            3.3.3.1 CLC1 在大肠杆菌细胞中被磷酸化
            3.3.3.2 CLC1 是否磷酸化在体外不影响与CHC2 相互作用
    3.4 百脉根CLC1 能竞争ROP6 与CHC2 的相互作用
    3.5 百脉根网格重链蛋白时空表达分析
        3.5.1 网格重链蛋白组织特异性表达分析
        3.5.2 网格重链蛋白在共生早期表达分析
        3.5.3 网格重链蛋白在根瘤中的表达分析
    3.6 CHC2 的RNAi影响结瘤数量
    3.7 CHC2 在百脉根根毛中的定位
        3.7.1 CHC2 在根毛中的定位
        3.7.2 CHC2 与NFR5 共定位
    3.8 总结
4 讨论与展望
    4.1 讨论
        4.1.1 CHC2 介导受体内吞参与结瘤因子信号传递
        4.1.2 ROP6 可能调节CHC2 的内吞间接参与结瘤因子信号转导
        4.1.3 磷酸化影响网格蛋白介导的受体内吞
    4.2 展望
参考文献
附录 1
附录 2
附录 3
附录 4
致谢



本文编号：3171671