酿酒酵母PMT1基因缺失延长细胞复制寿命的机制研究

发布时间：2017-04-24 22:04

  本文关键词：酿酒酵母PMT1基因缺失延长细胞复制寿命的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酿酒酵母蛋白质-氧-甘露糖转移酶(Protein-O-mannosyltransferase, PMT)家族共有七个成员(Pmtlp-Pmt7p),这些成员从酵母到哺乳动物都存在一定的保守性。PMT家族蛋白都定位于内质网,主要通过调控内质网未折叠蛋白质反应(unfolded protein response, UPR)参与调控内质网蛋白质的动态平衡。内质网应激感应因子Irel和转录因子Hacl参与调控UPR通路下游靶基因的表达,这些靶基因增强内质网对未折叠或错误折叠蛋白质的折叠处理能力,减轻内质网应激。在这一过程中,HAClmRNA被剪接是UPR通路激活的关键步骤。研究显示UPR和内质网应激在多种物种的衰老和衰老相关疾病的发生和发展中具有重要作用。研究内容与实验方法如下：1.依据基因同源重组的原理构建PMT家族单基因缺失(pmtl △～pmt6A)酵母菌株、PMT1与HAC1或IRE1双基因缺失(pmtl△hacl△和pmtl△irel△)酵母菌株模型。在Scope A I光学显微镜下,用玻璃纤维针对酵母母细胞和子细胞进行分离,并计数子细胞数量,统计分析酵母细胞复制寿命,研究PMT家族成员是否参与调控酵母细胞的复制寿命。采用RT-PCR检测pmtl△菌株中HACl mRNA的剪接情况,实时荧光定量PCR检测UPR通路中部分靶基因的转录水平,Western Blot检测内质网伴侣分子Kar2蛋白的表达水平,以探讨PMTl调控酵母细胞复制寿命与UPR信号通路的关系；2.依据基因同源重组的原理成功构建TED1基因缺失(tedl△)酵母菌株,PMTl与TED1双基因缺失(pmtl△tedl△)酵母菌株(Pmtlp和Tedlp形成复合物),以及PMT1与TED1和HAC1三基因缺失Cpmtl△tedl△hacl△)酵母菌株模型。采用酵母细胞复制寿命检测方法和实时荧光定量PCR方法,分析酵母菌株的寿命变化和UPR通路活性变化,研究PMT1与TED1在寿命调控方面是否存在关联,探讨UPR信号通路调控寿命的可能机制。3.分别用衣霉素和刚果红/荧光增白剂作为内质网应激和细胞壁应激的诱导剂,通过单克隆形成实验方法观察PMT1与TED1对细胞应激的敏感性。研究酵母细胞应激能力与UPR信号通路和细胞壁完整性通路的关系,进而探讨酵母细胞复制寿命与应激能力之间的调控关系。结果及结论如下：1.在PMT家族基因缺失酵母菌株中,仅pmtl△菌株平均复制寿命延长约20%(p0.0001),缺失HAC1或IRE1基因能缩短pmtl△菌株的复制寿命。缺失PMT1基因能诱导HAC1 mRNA剪接,进而上调UPR通路中部分下游靶基因的表达水平,这些靶基因包括内质网伴侣分子(KAR2和LHS1),参与蛋白质输出的基因(FKB2)和氧化折叠的基因(EUG1和ERO1)。同时,内质网伴侣分子Kar2蛋白表达水平也明显上调。这些结果提示PMT1基因缺失延长酵母细胞的复制寿命,寿命延长与UPR活性上调相关；2.与野生型酵母菌株比较,tedl△菌株平均复制寿命明显缩短约14%(p0.001),缺失PMT1基因能明显延长tedl△菌株的复制寿命,寿命延长依赖HAC1的存在。并且,缺失PMT1基因能诱导tedl△菌株HAC1 mRNA的剪接,上调UPR靶基因的表达水平。该结果提示缺失PMT1基因可能通过上调UPR活性来恢复tedl△菌株较短的复制寿命。3.野生型酵母菌株中缺失PMT1基因对内质网应激敏感,但是在hacl△菌株中缺失PMT1基因可以增强细胞对内质网应激的抗性。缺失PMT1基因可以导致tedl△菌株对内质网应激和细胞壁应激的敏感性。这表明长寿命的酵母菌株不一定具有较强的应激能力。综上所述,缺失PMT1基因可以延长野生型酵母细胞及tedl△菌株的复制寿命,寿命延长与UPR通路活性相关；尽管PMT1基因缺失可以诱导保护性UPR靶基因和参与细胞壁应激反应转录因子的表达上调,但是没有增强酵母细胞的应激能力。这提示酵母细胞复制寿命与应激能力之间复杂的调控关系还有待进一步深入研究。
【关键词】：糖基化 酵母 复制性寿命 未折叠蛋白质反应
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R339.36
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-19
• 第一部分 酿酒酵母PMT家族基因缺失对细胞复制寿命的影响19-48
• 1 材料与方法19-35
• 2 结果35-45
• 3 讨论45-47
• 4 小结47-48
• 第二部分 PMT1基因缺失延长TED1基因缺失菌株的复制寿命48-62
• 1 材料与方法48-54
• 2 结果54-60
• 3 讨论60-61
• 4 小结61-62
• 第三部分 PMT1和TED1调节酵母细胞应激反应62-71
• 1 材料与方法62-64
• 2 结果64-68
• 3 讨论68-70
• 4 小结70-71
• 全文总结71-72
• 本论文的特色与创新之处72-73
• 不足之处与后续研究73-74
• 参考文献74-81
• 附图81-85
• 文献综述85-95
• 参考文献91-95
• 致谢95-96
• 攻读博士学位期间发表的论文及主持与参与科研项目的情况96-97

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本文编号：325037