抗CD20片段抗体在拟南芥种子中的表达及其所引起的内质网应激响应

发布时间：2017-04-27 13:06

  本文关键词：抗CD20片段抗体在拟南芥种子中的表达及其所引起的内质网应激响应，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：分子农业（molecular farming）是指在植物中生产包括药用蛋白和工业蛋白在内的重组蛋白以及其他的次生代谢产物。目前已有多种哺乳动物来源的复杂蛋白在植物中获得了表达，如人血清蛋白、生长激素、抗体、疫苗、细胞因子等。 在植物生物反应器的各种表达手段中，利用种子表达系统生产重组蛋白具有很多的优点。作为一种天然的储藏器官，种子提供了一个稳定的环境，适于重组蛋白的长期存储，并且有利于重组蛋白的运输。尽管经过多年的不断发展植物生物反应器已经获得了巨大进步，但是对于不同亚细胞位置定向表达重组蛋白对宿主细胞的内质网质量控制系统的影响却知之甚少。 本研究中我们在野生型拟南芥Col-0和糖基化突变体TKO的种子中对抗CD20片段抗体进行了表达。首先我们通过PCR的技术分别将南芥2S2信号肽、大麦Amylase信号肽、内质网滞留信号SEKDEL与片段抗体的编码序列融合，构建了4套不同调控序列的植物表达载体，通过Floral Dip法对拟南芥进行了转化，经平皿筛选后共获得181株不同遗传背景和调控序列的转基因株系。通过Elisa、SDS-PAGE和Western Blot对转基因株系中重组蛋白的表达进行了鉴定。最高的表达量是通过融合拟南芥2S2种子储藏蛋白信号肽获得的，可达到总可溶性蛋白的6.12%。 通过Endo H和PNGase F处理，我们对纯化后的几种不同N-糖基结构的重组蛋白进行了N-糖基结构分析。WTC2B8SEKDEL的N-糖基结构成高甘露糖型，TKO背景scFv-Fc不存在岩藻糖及木质糖的修饰，WTC2B82S2的N-糖基结构部分以高甘露糖形式存在，但绝大部分为复杂型。通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒性（CDC）实验对重组蛋白的抗肿瘤活性进行了鉴定，，结果表明不含有岩藻糖修饰的片段抗体具有更强的ADCC能力，而植物源scFv-Fc的CDC能力较Rituximab有所减弱。 最后，在种子发育至13dpa（day post anthesis）时，我们通过qRT-PCR的方法对正常生长条件下和热激后宿主细胞的内质网应激反应进行了分析。基于内质网应激感应因子表达的变化，我们的结果表明在拟南芥种子中内质网定向表达重组蛋白对内质网的稳态施加了更大的压力，并且让其更易受到其他应激因素的胁迫。 qRT-PCR的结果同样也表明重组蛋白的表达不仅上调了宿主细胞中ERAD（ER-associated degradation）相关基因的表达，并使其质量控制系统变得更为复杂。而宿主的质量控制系统不仅影响着内源蛋白的合成、修饰和分泌，同时也对重组蛋白的终产量有着巨大的影响，因此研究不同亚细胞位置定向表达对宿主内稳态的影响可以为制定最佳表达策略提供思路，特别是考虑到在商业化种植过程中一些环境因素同样可以造成宿主的内质网应激。
【关键词】：植物生物反应器 拟南芥种子 抗CD20片段抗体 细胞介导的细胞毒性 补体依赖的细胞毒性 内质网应激响应 内质网关联的蛋白降解
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 第1章 文献综述13-41
• 1.1 植物源重组蛋白的概况13-24
• 1.1.1 单克隆抗体16-21
• 1.1.2 疫苗21-24
• 1.2 对重组蛋白表达量的优化24-29
• 1.2.1 转录、mRNA 稳定性和翻译的调控25-26
• 1.2.2 位置效应26-28
• 1.2.3 重组蛋白稳定性28
• 1.2.4 环境因素28-29
• 1.3 重组糖蛋白的糖基化修饰29-34
• 1.3.1 去除植物特异的糖基化修饰30-31
• 1.3.2 引入哺乳动物糖基转移酶及糖基供体31
• 1.3.3 调整糖基转移酶在细胞器中的位置31-32
• 1.3.4 通过瞬时表达重建修饰通路32-34
• 1.4 糖蛋白的内质网关联降解34-38
• 1.4.1 哺乳动物细胞和酵母中的 ERAD35-36
• 1.4.2 植物中的 ERAD36-38
• 1.5 植物生物反应器的发展前景38-41
• 第2章 抗 CD20 scFv-Fc 植物种子特异性表达载体的构建41-59
• 2.1 序言41-43
• 2.2 实验材料与设备43-44
• 2.2.1 实验材料43
• 2.2.2 实验设备43-44
• 2.3 实验方法44-51
• 2.3.1 2S2 和 Amy 信号肽编码序列、Ale-scFv-Fc 的基因序列合成44-46
• 2.3.2 引物设计46-47
• 2.3.3 2S2-scFv 和 Amy-scFv 的融合 PCR47-48
• 2.3.4 融合片段与 T1 载体的连接48
• 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞 DH5α的制备48-49
• 2.3.6 重组质粒 T1-2S2-scFv 和 T1-Amy-scFv 的转化和筛选49
• 2.3.7 重组质粒 T1-2S2-scFv-FcSEKDEL 的获得49-50
• 2.3.8 重组质粒 pPhasBar-2S2-scFv-Fc、pPhasBar-Amy-scFv-Fc、pPhasBar-Ale-scFv-Fc、pPhasBar-2S2-scFv-FcSEKDEL 的获得50-51
• 2.4 结果与分析51-56
• 2.4.1 重组质粒 T1-2S2-scFv-Fc 和 T1-Amy-scFv-Fc 的构建51-52
• 2.4.2 重组质粒 T1-2S2-scFv-FcSEKDEL 的构建52
• 2.4.3 重组质粒 pPhasBar-2S2-scFv-Fc、pPhasBar--Amy-scFv-Fc、pPhasBar-Ale-scFv-Fc、pPhasBar-2S2-scFv-FcSEKDEL 的构建52-56
• 2.5 讨论56-57
• 2.6 小结57-59
• 第3章 抗 CD20 scFv-Fc 的表达、纯化及抗肿瘤活性研究59-83
• 3.1 序言59
• 3.2 实验材料与设备59-62
• 3.2.1 实验材料59-61
• 3.2.2 实验设备61-62
• 3.3 实验方法62-69
• 3.3.1 农杆菌感受态的制备及冻融法转化62
• 3.3.2 拟南芥的种植及浸染法转化62-63
• 3.3.3 转基因拟南芥的筛选63-64
• 3.3.4 转基因拟南芥的 SDS-PAGE 及 Western Blot 检测64
• 3.3.5 重组蛋白表达量的夹心法 ELISA 及 BCA 检测64-65
• 3.3.6 重组蛋白的纯化65-66
• 3.3.7 重组蛋白的 N-糖基化分析66-67
• 3.3.8 细胞培养基本操作67
• 3.3.9 重组蛋白的 ADCC 能力鉴定67-68
• 3.3.10 重组蛋白的 CDC 能力鉴定68-69
• 3.4 结果与分析69-79
• 3.4.1 转基因株系的获得69-72
• 3.4.2 重组蛋白的表达鉴定72-75
• 3.4.3 重组蛋白的纯化及 N-糖基结构研究75-77
• 3.4.4 重组蛋白的 ADCC 和 CDC 活性研究77-79
• 3.5 讨论79-81
• 3.6 小结81-83
• 第4章 抗 CD20 scFv-Fc 在拟南芥种子中所引起的内质网应激响应83-97
• 4.1 序言83-84
• 4.2 实验材料与设备84-85
• 4.2.1 实验材料84
• 4.2.2 实验设备84-85
• 4.3 实验方法85-88
• 4.3.1 植株的培养及处理85
• 4.3.2 总 RNA 的提取及检测85
• 4.3.3 总 RNA 样本的处理及 cDNA 第一链的合成85-87
• 4.3.4 引物设计及 qRT-PCR87-88
• 4.4 结果与分析88-92
• 4.4.1 总 RNA 的提取88-90
• 4.4.2 不同转基因株系中 QC 相关基因的表达分析90-92
• 4.5 讨论92-95
• 4.6 小结95-97
• 参考文献97-113
• 附录一 溶液及抗生素配方113-117
• 附录二 测序结果117-121
• 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果121-123
• 致谢123

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 黄雪清;卫志明;;影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素[J];实验生物学报;2004年05期

  本文关键词：抗CD20片段抗体在拟南芥种子中的表达及其所引起的内质网应激响应，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330655