新城疫病毒V蛋白结合MDA5抑制DF-1细胞IFN-β生成的功能域研究

发布时间：2017-04-27 16:18

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【摘要】：新城疫(Newcastle diseases,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种严重危害多种禽类健康的病毒性传染病。NDV属于副黏病毒科(Paramyxovirudae)、禽副黏病毒属(Avulavirus)。病毒基因组为单股负链RNA,长度约为15 kb。随着NDV感染和致病宿主范围不断的扩大,ND的防控面临新挑战。干扰素系统在宿主抵抗病毒中发挥着举足轻重的作用,是宿主防御病毒的重要防线。研究发现,副黏病毒编码的的V蛋白能够通过拮抗宿主干扰素系统,逃逸宿主免疫系统的清除。近年来研究发现,NDV能够通过其P基因的RNA编辑作用产生V蛋白,编码产生的V蛋白能够抵御宿主干扰素系统。NDV V蛋白发挥拮抗干扰素的功能不仅体现在能够阻断干扰素JAK/STAT信号通路,还可以直接与模式识别受体MDA5结合,抑制IFN-β的产生。现有的研究表明,V蛋白与MDA5的结合区位于其C端的半胱氨酸富集区,但是具体是哪些氨基酸残基发挥关键作用,其他残基的作用如何,目前尚不清楚。此外,有研究推测V蛋白N端的一些残基在拮抗干扰素中也发挥一定作用。为了阐明NDV V蛋白结合MDA5抑制IFN-β生成的功能域,本研究在系统分析NDV与其他副黏病毒V蛋白CTD(C-terminal domain,CTD)区序列和N端可能存在功能域的基础上,突变单个或多个氨基酸残基,从IFN-β启动子、m RNA和蛋白水平以及与MDA5相互作用方面研究突变体对拮抗IFN-β的影响,对V蛋白干扰MDA5互作拮抗IFN-β产生的功能域做了详细的研究。研究分为以下几个部分:1、CTD区锌指结构氨基酸对新城疫病毒V蛋白与MDA5相互作用的影响为了探讨NDV V蛋白C端锌指结构的组氨酸和7个半胱氨酸残基在MDA5互作中的作用。参考副流感病毒5型(Parainfluenza virus type 5,PIV5)V蛋白C端的研究结果,模拟NDV V蛋白的锌指结构,并对锌指结构的组氨酸和7个半胱氨酸残基进行突变,在启动子、m RNA和蛋白水平检测V蛋白突变体过表达对DF-1细胞IFN-β的影响。结果显示,8个V蛋白突变体均构建成功并在DF-1细胞获得高效表达,且表达量与野生型一致;NDV的野生型V蛋白具有抑制poly(I:C)诱导的DF-1细胞IFN-β启动子活性,进而影响IFN-β的转录和翻译。V蛋白C端大锌指结构区域的H177、C196、C221和C224残基是V蛋白结合MDA5抑制DF-1细胞IFN-β非必需残基,而小锌指结构区域的C200、C212、C214和C217是必需残基。2、CTD区其他保守氨基酸对新城疫病毒V蛋白与MDA5相互作用的影响为了弄清NDV V蛋白CTD区除了形成锌指结构的8个氨基酸残基外其余保守氨基酸残基在结合MDA5抑制IFN-β产生的作用,选取15个保守氨基酸进行定点突变和MDA5共同转染细胞,检测DF-1细胞IFN-β启动子水平、m RNA水平和蛋白水平的差异情况,确定影响V蛋白与MDA5相互作用的关键性残基。结果表明,V蛋白的15个突变体在DF-1细胞中的表达量与野生型一致,R178和I183对于V蛋白抑制DF-1细胞IFN-β是必需的关键残基,精氨酸和异亮氨酸突变体不能与MDA5结合而失去拮抗宿主IFN-β的能力;E180对V蛋白起支持作用,而剩余的12个氨基酸残基是V蛋白结合MDA5非必需的,它们的点突变不影响V蛋白与MDA5的相互作用。并且178位的精氨酸R变为赖氨酸K时依然能够与MDA5结合,180位的谷氨酸E变为天冬氨酸D后也保持与MDA5的结合能力,说明178位、180位和183位分别是碱性氨基酸、酸性氨基酸和异亮氨酸是V蛋白结合MDA5必需的。3、新城疫病毒V蛋白N端氨基酸对V蛋白与MDA5相互作用的影响对NDV V蛋白N端某些氨基酸残基在V蛋白与MDA5结合中的作用进行研究,选择NDV V蛋白N端的7个氨基酸残基进行定点突变,应用荧光素酶报告基因系统、real time PCR和ELSA的方法检测突变体转染细胞后的干扰素水平,免疫共沉淀验证突变体与MDA5的相互作用情况。结果表明,V蛋白N端65位(N)残基对于V蛋白与MDA5的互作有轻微影响,突变之后DF-1细胞IFN-β水平有所升高,但并不明显,启动子、转录和蛋白水平上结果一致,但在共沉淀试验中却不能体现,提示NDV V蛋白的N端氨基酸残基对V蛋白拮抗宿主细胞IFN-β产生有轻微影响。综上所述,本研究较为详细的阐明了NDV V蛋白结合MDA5抑制宿主细胞IFN-β产生的主要功能域,研究表明V蛋白不同的氨基酸残基在结合MDA5抑制宿主细胞IFN-β产生方面发挥着不同的作用。本研究可为更深一步探究NDV V蛋白拮抗干扰素机理奠定基础。
【关键词】：新城疫病毒 V蛋白 黑色素瘤相关因子5 β干扰素 功能域
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-14
• 文献综述14-24
• 第一章 副黏病毒V蛋白拮抗干扰素的研究进展14-24
• 1.1 新城疫的概述14-15
• 1.2 新城疫病毒15-17
• 1.2.1 NDV的结构15
• 1.2.2 NDV的分型15-16
• 1.2.3 NDV的基因组16-17
• 1.3 副黏病毒拮抗干扰素的研究进展17-23
• 1.3.1 副黏病毒的P基因17-19
• 1.3.2 Ⅰ型IFN系统19-20
• 1.3.3 副黏病毒拮抗IFN的细胞目标20-22
• 1.3.4 副黏病毒阻断干扰素Jak/STAT信号通路22-23
• 1.4 本研究的目的意义23-24
• 试验研究24-64
• 第二章CTD区锌指结构氨基酸对NDV V蛋白与MDA5 互作抑制IFN-β 生成的影响 1124-39
• 2.1 材料24
• 2.1.1 质粒24
• 2.1.2 细胞24
• 2.2 方法24-30
• 2.2.1 副黏病毒V蛋白CTD区的序列分析24
• 2.2.2 点突变引物设计24-25
• 2.2.3 重组质粒pCMV-3HA- H/C1~C7 的构建25-26
• 2.2.4 ChMDA5 真核表达载体的构建26
• 2.2.5 Western blotting检测目的蛋白的表达26-27
• 2.2.6 双荧光素酶报告基因系统检测IFN-β 启动子活性27-28
• 2.2.7 Real time PCR测定IFN-β mRNA水平28
• 2.2.8 ELISA测定IFN-β 蛋白水平28
• 2.2.9 免疫共沉淀试验验证V蛋白突变体与MDA5 的相互作用28-29
• 2.2.10 多个氨基酸突变的影响29-30
• 2.3 结果30-37
• 2.3.1 副黏病毒V蛋白CTD区的序列比对结果30-31
• 2.3.2 重组质粒pCMV-3HA-H/C1~C7 的构建31-32
• 2.3.3 ChMDA5 真核表达载体的构建32-33
• 2.3.4 V蛋白及突变体表达的检测33
• 2.3.5 IFN-β 启动子活性检测33-34
• 2.3.6 IFN-β mRNA检测34-35
• 2.3.7 IFN-β 蛋白检测35-36
• 2.3.8 V蛋白及V蛋白突变体与MDA5 相互作用检测36
• 2.3.9 多个氨基酸突变对V蛋白功能的影响36-37
• 2.4 讨论37-38
• 2.5 小结38-39
• 第三章CTD区其他保守氨基酸对NDV V蛋白与MDA5 互作抑制IFN-β生成的影响39-53
• 3.1 材料39
• 3.1.1 质粒39
• 3.1.2 细胞39
• 3.2 方法39-44
• 3.2.1 副黏病毒V蛋白CTD区的序列分析39
• 3.2.2 点突变引物设计39-41
• 3.2.3 重组质粒pCMV-3HA-△V的构建41
• 3.2.4 Western blotting检测V蛋白突变体表达41
• 3.2.5 双荧光素酶报告基因检测IFN-β 启动子活性41-42
• 3.2.6 real time PCR测定IFN-β mRNA水平42
• 3.2.7 ELISA测定IFN-β 蛋白水平42
• 3.2.8 免疫共沉淀试验验证V蛋白突变体与MDA5 的相互作用42-44
• 3.2.9 几个重要氨基酸的确定44
• 3.3 结果44-50
• 3.3.1 重组质粒pCMV-3HA-△V的构建44-45
• 3.3.2 V蛋白突变体表达的检测45-46
• 3.3.3 IFN-β 启动子活性检测46-47
• 3.3.4 IFN-β mRNA检测47
• 3.3.5 IFN-β 蛋白检测47-48
• 3.3.6 V蛋白及V蛋白突变体与MDA5 相互作用检测48-49
• 3.3.7 R178 和E180 对V蛋白的影响49-50
• 3.4 讨论50-52
• 3.5 小结52-53
• 第四章 新城疫病毒V蛋白N端氨基酸对V蛋白与MDA5 相互作用抑制IFN-β生成的影响53-64
• 4.1 材料53
• 4.1.1 质粒53
• 4.1.2 细胞53
• 4.2 方法53-58
• 4.2.1 不同NDV V蛋白的序列分析53-54
• 4.2.2 点突变引物设计54
• 4.2.3 重组质粒pCMV-3HA-△V的构建54-55
• 4.2.4 Western blotting检测V蛋白突变体的表达55-56
• 4.2.5 双荧光素酶报告基因检测IFN-β 启动子活性56
• 4.2.6 real time PCR测定IFN-β mRNA水平56
• 4.2.7 ELISA测定IFN-β 蛋白水平56-57
• 4.2.8 免疫共沉淀试验验证V蛋白突变体与MDA5 的相互作用57-58
• 4.3 结果58-62
• 4.3.1 重组质粒pCMV-3HA-△V的构建58-59
• 4.3.2 V蛋白突变体表达的检测59-60
• 4.3.3 IFN-β 启动子活性检测60
• 4.3.4 IFN-β mRNA检测60-61
• 4.3.5 IFN-β 蛋白检测61-62
• 4.3.6 V蛋白N端突变体与MDA5 相互作用检测62
• 4.4 讨论62-63
• 4.5 小结63-64
• 结论64-65
• 本论文的创新点65-66
• 参考文献66-77
• 附录77-81
• 缩略词表81-83
• 致谢83-84
• 作者简介84-85

【参考文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 陈胜利;不同宿主来源新城疫病毒全基因组特征及其V蛋白对DF-1细胞IFN-β生成的影响[D];西北农林科技大学;2013年

  本文关键词：新城疫病毒V蛋白结合MDA5抑制DF-1细胞IFN-β生成的功能域研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：330983