醉马草内生真菌分子检测、基因型及产碱多样性的研究

发布时间：2017-04-28 16:15

  本文关键词：醉马草内生真菌分子检测、基因型及产碱多样性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：醉马草(Achnatherum inebrians)为禾本科芨芨草属的多年生烈性毒草,内生真菌与醉马草形成的共生体产生的次生代谢物质是引起家畜中毒的原因。本论文以采自甘肃、内蒙古、新疆等3个省(自治区)的8个醉马草种群为材料,分离获得了醉马草内生真菌Epichlo?gansuensis(Eg)和Epichlo?gansuensis var.inebrians(Ei),进行了Eg和Ei菌株的形态比较、全基因组测序和比较基因组分析,测定了共生体的生物碱成分和含量,分析了共生体种群多样性及其分子系统发生关系。所获主要结果如下:1、从8个醉马草种群的种子和幼苗中分离纯培养得到Ei和Eg两类醉马草:Ei菌株e7478、e818-1……e818-10、e817-1……e817-10、ep4914、ep4916、NFR-2、eAIM-1、eXH-B1、eXH-B2、eXH-C共28个;Eg菌株eA168、eA169、eA170、eA171、eA172、e A173、eA185和eA186共8个。供试的8个醉马草种群中都有Ei基因型,且它是其中6个种群的唯一基因型,而甘肃肃南SNB种群中的SNB-1、SNB-4和SNB-5种样的所有单株为Eg基因型。2、建立了适用于醉马草内生真菌的多基因PCR分子检测和鉴定方法,包括Ei麦角生物碱合成相关基因dmaW,Eg吲哚二萜类生物碱合成相关基因idt G,交配型基因mtA和mt B,以及当家基因tefA,获得了醉马草内生真菌dma W,idtG,mtA和mtB基因的特异性引物。Ei和Eg的交配型不同,Ei为mtA,Eg为mtB。3、对分离得到的Ei菌株e818-5和e7478进行了全基因组测序,并与已完成测序的Eg菌株e7080进行了比较基因组研究,发现参试的Ei菌株e818-5和e7478的基因组大小相近,分别为29.8Mb和25.4Mb,Eg菌株e7080的基因组为39.5 Mb。Ei菌株都有麦角类生物碱合成所需的基因簇EAS1和EAS2(Genebank:JX072969和JX273434),但没有吲哚二萜类生物碱合成所需的基因簇IDT;与Ei相反,Eg有吲哚二萜类生物碱合成所需的基因簇IDT,但是没有合成麦角类生物碱的EAS基因簇。Ei和Eg两者的基因组中都只有单拷贝的当家基因。4、人工接种构建了e7080-醉马草共生体。采用质谱分析(MS)方法,对新构建的Eg7080醉马草共生体、Ei醉马草共生体和E-醉马草生物碱成分和含量进行了检测,结果发现Ei醉马草中含有麦角类生物碱,包括大量的麦角新碱和麦角酸α羟基乙酰胺,少量的麦角酰胺和裸麦角碱;新构建的Eg菌株e7080与醉马草共生产生吲哚二萜类生物碱,包括大量的paspaline,少量的13-desoxypaxilline和paxilline,微量的paspaline B;而E-醉马草中没有检测到麦角类生物碱和吲哚二萜类生物碱。醉马草内生真菌共生体所含生物碱的化学类型和与其共生的菌株的产碱基因型是一致的。5、分子系统发生关系研究发现,3个不同的Ei菌株e818,e817,e7478总是同属一个分枝,Ei、Eg和Epichlo?sibirica的亲缘关系较近,能够归入一个分枝,这三个已鉴定的亚洲芨芨草种的Epichlo?内生真菌代表一个与其他已知的Epichlo?种进化起源不同的家族系。Ei、Eg与Achnatherum pekinense和Epichlo?guerinii的亲缘关系也较近。综上,将Ei醉马草内生真菌从变种提升到种的水平,并将其重命名为Epichlo?inebrians,并已正式发表。
【关键词】：醉马草 内生真菌 Epichlo?gansuensis Epichlo?inebrians 麦角菌科 肉座菌 共生 有毒禾草 麦角生物碱 基因组测序 分子系统发育
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S452;S182
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 前言9-11
• 第一章 文献综述11-19
• 1.1 醉马草11-12
• 1.2 内生真菌12-15
• 1.2.1 内生真菌的定义和分类12-13
• 1.2.2 内生真菌的生长、传播和繁殖13-15
• 1.3 禾草内生真菌共生体研究进展15-17
• 1.3.1 禾草和内生真菌的关系15-16
• 1.3.2 禾草内生真菌的分离和检测研究进展16
• 1.3.3 禾草内生真菌生物碱合成基因及其基因组研究进展16-17
• 1.4 醉马草内生真菌共生体研究进展17-19
• 第二章 醉马草内生真菌分子检测、鉴定与共生体构建19-32
• 2.1 引言19-20
• 2.2 材料与方法20-23
• 2.2.1 供试材料20
• 2.2.2 醉马草内生真菌的分离培养20
• 2.2.3 醉马草内生真菌DNA提取20-21
• 2.2.4 醉马草内生真菌的分子检测21-22
• 2.2.5 醉马草－内生真菌共生体构建22
• 2.2.6 新的共生体内生真菌验证及生物碱检测22-23
• 2.2.7 数据分析与作图23
• 2.3 结果与讨论23-30
• 2.3.1 分离获得的醉马草内生真菌菌株23-24
• 2.3.2 醉马草内生真菌当家基因24-26
• 2.3.3 醉马草内生真菌生物碱合成相关基因26-28
• 2.3.4 醉马草内生真菌共生体多基因PCR体系28-30
• 2.3.5 构建的醉马草内生真菌共生体30
• 2.4 小结30-32
• 第三章 醉马草内生真菌生物碱合成相关基因及基因组研究32-46
• 3.1 引言32
• 3.2 材料与方法32-34
• 3.2.1 供试内生真菌菌株32-33
• 3.2.2 醉马草内生真菌的继代培养及DNA提取33
• 3.2.3 醉马草内生真菌DNA全基因组测序33
• 3.2.4 醉马草内生真菌生物碱合成基因注释33-34
• 3.2.5 数据分析与作图34
• 3.3 结果与讨论34-44
• 3.3.1 醉马草内生真菌全基因组34-36
• 3.3.2 醉马草内生真菌Ei和Eg菌株生物碱基因型比较36-40
• 3.3.3 醉马草内生真菌Ei和Eg菌株共生体生物碱类型40-44
• 3.4 小结44-46
• 第四章 醉马草内生真菌共生体基因型多样性研究46-55
• 4.1 引言46
• 4.2 材料与方法46-50
• 4.2.1 供试材料46-48
• 4.2.2 醉马草温室培养条件48
• 4.2.3 内生真菌及其共生体DNA提取48-49
• 4.2.4 多基因PCR扩增反应49-50
• 4.2.5 醉马草内生真菌共生体生物碱类型检测50
• 4.2.6 数据分析与作图50
• 4.3 结果与讨论50-54
• 4.3.1 不同种群醉马草内生真菌共生体基因型比较50-51
• 4.3.2 不同种群醉马草内生真菌分离与菌株基因型51-53
• 4.3.3 醉马草内生真菌交配型及共生繁殖特性53-54
• 4.4 小结54-55
• 第五章 甘肃醉马草内生真菌变种的分类地位研究55-63
• 5.1 引言55-56
• 5.2 材料与方法56-57
• 5.2.1 菌株材料56
• 5.2.2 分子进化分析基因选择56
• 5.2.3 基因注释及相关搜索56
• 5.2.4 数据分析与作图56-57
• 5.3 结果与讨论57-61
• 5.3.1 醉马草内生真菌分子进化关系分析体系57
• 5.3.2 醉马草内生真菌分子系统发育57-61
• 5.3.3 分类学61
• 5.4 小结61-63
• 第六章 结论、创新点及今后的工作63-65
• 6.1 结论63-64
• 6.2 创新点64
• 6.3 今后的工作64-65
• 附录65-75
• 缩写75-76
• 参考文献76-84
• 在学期间发表论文84-86
• 项目资助86-87
• 致谢87

  本文关键词：醉马草内生真菌分子检测、基因型及产碱多样性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：333121