拟南芥ABS3亚家族MATE转运蛋白参与调控植物细胞伸长和叶片衰老的机制研究

发布时间：2017-05-01 03:03

  本文关键词：拟南芥ABS3亚家族MATE转运蛋白参与调控植物细胞伸长和叶片衰老的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高等植物的生长发育受到基因、激素等内在因素的精密调控,并受到复杂多变的外在环境因子影响。为了研究植物生长发育的遗传调控机制,本实验室以模式植物拟南芥为研究对象,利用激活标签技术构建了大规模拟南芥突变体库。通过遗传筛选,分离出一系列具有植物地上部分生长发育异常表型的突变体并命名为abnormal shoot(abs)系列突变体。本研究以拟南芥发育突变体的筛选为出发点,鉴定获得两株独立的具有矮化丛生表型的拟南芥突变体abs3-1D和abs4-1D。分子克隆及验证表明abs3-1D和abs4-1D的表型分别是由ABS3和ABS4基因的表达激活,即过表达引起。ABS3和ABS4分别编码拟南芥Multidrug and Toxic Compound Extrusion(MATE)转运蛋白且ABS3和ABS4属于MATE家族中的同一进化分枝(本论文称为ABS3亚家族MATE转运蛋白)。本论文通过对ABS3、ABS4以及另外两个与ABS3同源的MATE家族蛋白ABS3L1和ABS3L2等四个ABS3亚家族拟南芥MATE转运蛋白参与调控植物发育的机理开展研究,主要获得以下结果。(1)在激活标签突变体库中,发现两株具有矮化丛生表型的半显性突变体abs3-1D和abs4-1D,通过基因克隆,证明这两个突变体的异常表型分别是由ABS3和ABS4基因过表达引起。ABS3和ABS4基因的编码产物同属于拟南芥MATE转运蛋白家族的同一进化分枝,根据序列比对结果,发现这一分枝中的另外两个蛋白ABS3L1和ABS3L2与ABS3高度同源。ABS3L1和ABS3L2过表达也可以使植物产生类似于abs3-1D的突变体表型。这些结果表明ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2可能在植物生长发育过程中具有相似的功能。(2)利用半定量RT-PCR分别检测ABS3、ABS4、ABS3L1以及ABS3L2基因在拟南芥不同组织和发育阶段的时空表达特异性。分别构建这四个基因的启动子-GUS融合表达载体并获得转基因植物,GUS组织染色表明在拟南芥的不同生长发育时期这四个基因具有不同的组织器官特异表达特征。(3)构建ABS3、ABS4、ABS3L1以及ABS3L2融合荧光蛋白的瞬时表达载体,利用拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达系统,结合与不同细胞器标志蛋白的共定位分析,对这四个蛋白的亚细胞定位进行研究。发现这四个蛋白在细胞中具有高度类似的定位模式,能够定位在前液泡/次级内体(PVC/LE)上。(4)分别对ABS3、ABS4、ABS3L1以及ABS3L2的T-DNA插入基因功能缺失突变体abs3-1、abs4-1、abs3l1-1和abs3l2-1进行表型分析,发现由于基因功能冗余,在正常生长条件下与野生型相比,单基因功能缺失突变体并没有表现出明显的表型。进一步构建了abs3-1 abs4-1 abs3l1-1 abs3l2-1四重功能缺失突变体(mateq),并发现mateq具有明显的发育异常表型。(5)以拟南芥下胚轴表皮细胞为研究对象,研究了ABS3及其亚家族基因参与植物细胞伸长的调控过程。观察发现abs3-1D与abs4-1D具有光下下胚轴变短的表型,且在细胞水平上表现为下胚轴表皮细胞伸长受到抑制。相反,在光照下mateq的下胚轴伸长抑制一定程度上被解除,与野生型相比下胚轴表皮细胞伸长加剧。这些结果表明在光照下拟南芥ABS3亚家族MATE转运蛋白参与对下胚轴表皮细胞伸长的负调控。(6)进一步研究ABS3及其亚家族基因参与对黑暗中下胚轴表皮细胞伸长的调控过程。对ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2基因的过表达转基因植物,以及四基因缺失突变体mateq在黑暗中生长的下胚轴伸长表型进行观察后发现,ABS3及其亚家族基因过表达能明显抑制黑暗中下胚轴表皮细胞伸长,但是abs3-1D和abs4-1D中下胚轴伸长的抑制能够被外源添加的蔗糖解除。而在mateq中,基因的缺失结合外源添加蔗糖,能够进一步促进黑暗中下胚轴表皮细胞的伸长。这些结果表明在黑暗中这类MATE转运蛋白亚家族对拟南芥下胚轴表皮细胞伸长具有负调控作用,且受外源添加蔗糖影响。(7)在对abs3-1D的逆转突变体筛选过程中,筛选到逆转突变体F07-08单突变体为光敏色素B(PHYB)基因的突变体,发现PHYB基因突变能够明显逆转abs3-1D和abs4-1D的叶片叶柄以及下胚轴伸长受抑制的表型。这些结果表明ABS3与PHYB之间存在遗传互作。(8)观察发现abs3-1D的黑暗诱导叶片衰老进程明显提前,而mateq叶片则表现出黑暗诱导叶片衰老过程抑制的表型。通过叶片黑暗处理,发现abs3-1D叶片衰老表型明显,与野生型相比衰老叶片失绿迅速,光合能力下降明显,衰老诱导基因表达提前,叶片蛋白降解加快。而mateq生理生化水平的衰老相关表型均受到抑制。这些结果表明ABS3及其亚家族基因参与对黑暗诱导叶片衰老的正向调控。(9)对abs3-1D以及mateq进行营养缺失处理。结果表明在碳素缺失和氮素缺失的条件下,abs3-1D均表现出叶片衰老提前的表型,而mateq一定程度上表现为持绿的表型。这些结果表明ABS3及其亚家族基因正向调控营养缺失诱导叶片衰老。
【关键词】：abnormal shoot(abs) MATE转运蛋白 内体 细胞伸长 叶片衰老
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文献综述11-22
• 1.1 MATE家族多药外排蛋白11-13
• 1.1.1 多药外排泵11
• 1.1.2 多药及毒性化合物外排家族（MATE）转运蛋白11-13
• 1.2 拟南芥下胚轴细胞伸长及调控13-15
• 1.2.1 植物细胞伸长13
• 1.2.2 拟南芥下胚轴细胞伸长的调控13-15
• 1.3 拟南芥叶片衰老及调控15-19
• 1.3.1 叶片衰老15-17
• 1.3.2 叶片衰老的调控17-19
• 1.4 选题依据和主要研究内容19-22
• 1.4.1 选题依据19-20
• 1.4.2 主要研究内容20-22
• 第二章 拟南芥abs3-1D和abs4-1D突变体的筛选及基因克隆22-50
• 2.1 引言22
• 2.2 材料及方法22-29
• 2.2.1 实验材料22-25
• 2.2.2 实验方法25-29
• 2.3 研究结果29-48
• 2.3.1 拟南芥发育异常表型突变体abs3-1D和abs4-1D的筛选29-32
• 2.3.2 拟南芥MATE亚家族蛋白基因ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2的克隆32-38
• 2.3.3 ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2基因的表达调控模式38-41
• 2.3.4 ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2蛋白的亚细胞定位41-46
• 2.3.5 ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2基因功能缺失突变体的获得以及四重功能缺失突变体（mateq）的构建46-48
• 2.4 讨论48-50
• 第三章 拟南芥ABS3及其亚家族同源基因参与下胚轴细胞伸长的调控50-77
• 3.1 引言50
• 3.2 材料及方法50-52
• 3.2.1 实验材料50-51
• 3.2.2 实验方法51-52
• 3.3 研究结果52-75
• 3.3.1 ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2基因参与光下下胚轴细胞伸长的负调控52-57
• 3.3.2 ABS3、ABS4、ABS3L1和ABS3L2基因参与黑暗中下胚轴细胞伸长的负调控57-71
• 3.3.3 ABS3和ABS4基因与PHYB的遗传互作71-75
• 3.4 讨论75-77
• 第四章 拟南芥ABS3及其亚家族同源基因参与黑暗诱导叶片衰老的调控77-94
• 4.1 引言77
• 4.2 材料及方法77-81
• 4.2.1 实验材料77-79
• 4.2.2 实验方法79-81
• 4.3 研究结果81-92
• 4.3.1 ABS3及其亚家族基因对黑暗诱导叶片衰老的影响81-82
• 4.3.2 ABS3及其亚家族基因对独立黑暗诱导叶片衰老的影响82-84
• 4.3.3 野生型、abs3-1D与mateq衰老叶片中衰老相关基因的表达量分析84-85
• 4.3.4 野生型、abs3-1D与mateq衰老叶片中蛋白含量的比较85-87
• 4.3.5 ABS3亚家族基因在黑暗诱导衰老过程中的表达模式87-88
• 4.3.6 ABS3及其亚家族基因对营养缺失诱导衰老的影响88-92
• 4.4 讨论92-94
• 第五章 结论94-98
• 5.1 主要研究结果94-96
• 5.1.1 abs3-1D以及abs4-1D突变体的筛选以及突变基因的克隆94
• 5.1.2 ABS3及其亚家族基因参与对拟南芥下胚轴细胞伸长调控94-95
• 5.1.3 ABS3及其亚家族基因参与对拟南芥叶片衰老调控95-96
• 5.2 下一步研究计划96-97
• 5.2.1 对ABS3及其亚家族蛋白在内膜运输系统中定位的进一步研究96
• 5.2.2 对ABS3及其亚家族蛋白参与叶绿体降解的研究96
• 5.2.3 对ABS3及其亚家族蛋白参与细胞自噬途径的研究96-97
• 5.3 本研究的创新点97-98
• 参考文献98-107
• 附录1 引物列表107-110
• 缩略词表110-111
• 致谢111-112
• 作者简介112

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