米曲霉基因组水平的蛋白质和DNA相互作用研究

发布时间：2021-10-24 04:46

　　真核细胞中蛋白质和DNA相互作用的相关研究对于理解其功能基因组及其调控机制有着重要的意义。工业丝状真菌米曲霉的基因组中已预测有570个转录因子编码基因,在现阶段只有大约5%的转录因子通过传统的方法被鉴定,大部分转录因子未见报导,并且对米曲霉转录因子在基因组上结合位点的信息及其调控机制知之甚少。本论文将传统的DNase足迹法与新一代高通量测序技术结合（DNase-seq）,在全基因组水平研究米曲霉的蛋白质和DNA相互作用模式,解析基因组上的不同类型转录因子结合位点及其调控机制。本文的研究结果主要由以下几个方面组成:（1）利用DNase-seq技术在基因组水平鉴定DNase足迹位点基于传统的DNase I足迹法构建米曲霉不同生理状态下DNase I酶切测序文库,荧光定量PCR方法验证酶切文库质量,结合高通量测序技术与生物信息工具分析获得丰富营养和内质网压力诱导培养条件下高通量的基因组DNase-seq数据,在基因组水平上分析获得160M和100M的酶切位点信息。基于上述全基因组DNase I酶切图谱和搜寻DNase足迹位点的算法,在FDR<0.1的标准下,分别在米曲霉基因组水平上获得... 

【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：148 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略词
第一章 绪论
    1.1 真核生物的基因转录调控机制概述
        1.1.1 真核生物细胞中基因的转录
        1.1.2 真核细胞的转录因子和转录因子结合位点
        1.1.3 染色质结构和基因转录间相互关系的研究
    1.2 蛋白质和DNA相互作用的研究方法
        1.2.1 传统的蛋白质和DNA相互作用研究方法
        1.2.2 基于全基因组水平的研究方法
        1.2.3 基因转录调控的高通量分析方法
    1.3 工业微生物米曲霉的转录调控研究
        1.3.1 米曲霉功能基因组学的研究进展
        1.3.2 米曲霉中转录因子及其调控机制的研究进展
    1.4 研究意义及内容
        1.4.1 研究意义
        1.4.2 研究内容
第二章 米曲霉DNase-seq测序及DNase足迹位点预测分析
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 试剂
        2.2.2 仪器
        2.2.3 软件
        2.2.4 数据
    2.3 实验方法
        2.3.1 实验中所使用的米曲霉菌种
        2.3.2 丰富营养的培养条件（DPY）
        2.3.3 基本营养条件下内质网压力诱导（UPR）
        2.3.4 米曲霉细胞核的提取方法
        2.3.5 细胞核DNase I酶切反应条件的优化
        2.3.6 细胞核DNase I酶切反应
        2.3.7 利用荧光定量PCR反应验证DNase I酶切产物的质量
        2.3.8 DNase-seq中的建库和测序流程
        2.3.9 DNase-seq测序结果与米曲霉参考基因组比对
        2.3.10 计算米曲霉基因组每个位点上的DNase I酶切频率
        2.3.11 利用“digital footprinting”算法预测基因组上的DNase足迹位点
        2.3.12 不同培养条件下DNase足迹位点分布的比较
        2.3.13基因的GO功能富集分析
    2.4 结果与讨论
        2.4.1 米曲霉细胞核提取物的DNase I酶切反应优化和产物分析
        2.4.2 荧光定量PCR反应验证DNase I酶切产物质量
        2.4.3 DNase-seq数据全基因组比对结果的分析
        2.4.4 DNase足迹位点分析
        2.4.5 不同培养条件下重叠DNase足迹位点的比较分析
        2.4.6 本章小结
第三章 基于DNase足迹位点DNA序列的转录因子结合位点预测
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 软件
        3.2.2 仪器
        3.2.3 数据
    3.3 实验方法
        3.3.1 提取DNase足迹位点的DNA序列
        3.3.2 利用MEME发现新的motif
        3.3.3 利用FIMO寻找DNase足迹位点序列中每个motif的候选位点
        3.3.4 利用Tomtom注释每个motif
        3.3.5 绘制每个motif的酶切密度图
        3.3.6 GO功能富集
        3.3.7 Web Logo
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 基于DNase足迹位点序列鉴定DNA基序
        3.4.2 鉴定motif的功能和酶切图谱
    3.5 本章小结
第四章 丰富营养状态下米曲霉的基因表达和转录起始位点分析
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 试剂
        4.2.2 软件
        4.2.3 仪器
        4.2.4 数据
    4.3 实验方法
        4.3.1 提取细胞总RNA
        4.3.2 建立链特异性转录组文库并测序
        4.3.3 测序数据的过滤和比对
        4.3.4 基因比对随机性评估
        4.3.5 确定基因转录水平
        4.3.6 不同培养条件下差异表达基因的功能分析
        4.3.7 注释基因 5’ UTR和转录起始位点
        4.3.8 GO功能富集
    4.4 结果与讨论
        4.4.1 链特异性转录组分析概要
        4.4.2 基因测序随机性和基因组覆盖度评估
        4.4.3 丰富营养培养状态下的基因表达
        4.4.4 丰富和基本营养条件下米曲霉的基因差异表达分析
        4.4.5 重新注释基因的转录起始位点
    4.5 本章小结
第五章 转录起始位点上下游区域的染色质结构研究
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 软件
        5.2.2 仪器
        5.2.3 数据
    5.3 实验方法
        5.3.1 分析基因转录起始位点周围的酶切密度图
        5.3.2 分析不同类基因的转录起始位点上下游区域酶切模式
        5.3.3 基因上游DNase足迹位点的分布
        5.3.4 GO功能富集
    5.4 结果与讨论
        5.4.1 转录起始位点附近区域的DNase I酶切图谱
        5.4.2 不同 5’ UTR长度和转录水平之间基因上游的染色质结构差异
        5.4.3 基因上游酶切数据的聚类分析
        5.4.4 基因上游DNase足迹位点的分布情况
    5.5 本章小结
第六章 米曲霉基因组上转录因子结合位点的研究
    6.1 引言
    6.2 实验材料
        6.2.1 软件
        6.2.2 数据
        6.2.3 仪器
    6.3 实验方法
        6.3.1 匹配基因启动子区域的motif候选位点
        6.3.2 基因组中的DNase I超敏感位点
        6.3.3 计算候选位点的转录因子结合概率
        6.3.4 数据过滤
        6.3.5 链特异性酶切图谱和结构分析
        6.3.6 GO功能富集
    6.4 结果与讨论
        6.4.1 染色体的DNase I超敏感区域
        6.4.219个已知motif的链特异性酶切模式分析
        6.4.3 5 个转录因子蛋白质共结晶结构和motif的酶切模式比对分析
        6.4.4 本章小结
结论与展望
参考文献
附录
攻读博士学位期间取得的研究成果
致谢
附件



本文编号：3454601