南四湖流域典型人工湿地植物资源化研究

发布时间：2017-05-12 16:03

  本文关键词：南四湖流域典型人工湿地植物资源化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：南四湖流域是南水北调东线工程输水干线及调蓄湖区,为了保障调水水质及流域生态环境安全,山东省采用“治,用,保”并进的战略围绕南四湖流域水质的核心问题开展了大规模治理行动,并取得显著的效果,其中“保”就是生态修复和保护,通过流域内生态环境系统的恢复重建,充分发挥生态系统水质净化服务功能,治理过程中以湖滨带规模化退耕还湿及河口人工湿地建设作为核心内容。实践证明,恢复重建后的南四湖湿地生态系统在减少流域面源污染、水质的改善以及突发污染缓冲中起着重要作用。在流域治污取得显著成果的同时,南四湖人工湿地规模化建设过程中也存在着一些问题,首先是由于湿地植物的管理滞后等原因造成的人工湿地植物收割不及时可能造成二次污染；其次,规模化湿地修复重建过程中产生的大量生态补偿资金缺口。高附加值的湿地植物资源化开发利用技术是推进人工湿地可持续运行及流域生态恢复重建的关键支撑技术。在这一背景下,本研究想要解决的主要问题是如何针对南四湖流域人工湿地植物特点对其进行高附加值资源化利用,从而实现以利用促进流域生态环境的保护。为了解决这一问题,本论文提出了基于活性植物天然产物的人工湿地植物资源化思路。天然产物一直以来都是药物研发的重要来源,目前超过50%的抗肿瘤药物是来源自天然产物或是经由天然产物结构修饰的半合成产物。由于植物体内活性天然产物较低的含量,天然产物的规模化利用需要大量的植物生物量,这成为制约天然产物产业化的主要障碍,而人工湿地中大量的植物资源为进行基于活性天然产物的植物资源化提供了潜在的可能性。研究中对南四湖流域湿地植物资源进行全面调查,调查中发现高等维管植物共计128种,属于47科,117属。基于植物资源调查结果及流域植物资源化开发现状,选择四种在南四湖流域广泛分布的人工湿地优势植物种：荇菜(Nymphoides peltatum (Gmel.) O. Kuntze)、菹草(Potamogeton crispus L.)、莲(Nelumbo nuciferaGaertn)、空心莲子草(Alternanthera philoxeroides (Mart.) Griseb),进行研究。植物材料采集后,首先提取得到植物总次生代谢产物,然后通过评价其对肿瘤细胞抑制活性初步筛选具有抗肿瘤活性的湿地植物。实验结果表明菹草,荇菜,莲的总代谢产物具有一定的肿瘤抑制活性。实验中还重点对南四湖流域恶性入侵植物空心莲子的抗肿瘤活性进行评价,分别采集空心莲子草早春幼苗及夏季成熟植株进行次生代谢产物提取,液相分析结果显示空心莲子草幼苗具有含量及种类更丰富的代谢产物组分,但实验结果表明空心莲子草幼苗提取物及成熟植株提取物对多种人肿瘤细胞均无抑制作用。根据活性筛选结果,进一步对具有较好抗肿瘤活性的荇菜及菹草进行活性成份筛选。荇菜次生代谢产物提取后,按极性分段,并评价不同极性部位对PC3及U2OS肿瘤细胞的抑制活性,结果表明荇菜提取物低极性部分具有相对显著的肿瘤抑制活性,采用硅胶柱层析色谱及葡聚糖凝胶色谱技术对其活性部位主要组分进行分离纯化,并通过LC-Q-TOF-MS/MS技术鉴定ephedrine, ephedradine C,4-hydroxycoumarine, Delta-1-dehydrotanshinone为其主要组分。该结果为南四湖流域荇菜的高附加值资源化利用提供了基础科学证据。菹草总次生代谢产物被石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种溶剂依次萃取后,以人类卵巢癌肿瘤细胞ES-2和人乳腺癌细胞MDA-MB-231为实验对象,评价三部分提取物的肿瘤抑制活性。实验结果显示菹草乙酸乙酯部分提取物具有比较高的肿瘤抑制活性,MDA-MB-231肿瘤细胞对其更为敏感。细胞形态观察发现菹草乙酸乙酯提取物能够影响MDA-MB-231细胞的形态学特征。研究中进一步评价该部分提取物对MDA-MB-231肿瘤细胞细胞周期进程的影响及细胞增殖抑制机制,细胞周期实验结果表明该活性部位可以导致细胞周期进程位于S期与G2期过渡段的停滞,细胞凋亡实验结果表明该提取物在中低浓度下促进细胞凋亡,高浓度下可导致细胞坏死。此外细胞划痕实验结果表明乙酸乙酯部分提取物能有效抑制体外培养的小鼠成纤维细胞L929的迁移活性。综上所述,可以确定菹草乙酸乙酯提取物是菹草的活性部位,并对其进行进一步的分离纯化。通过MCI柱色谱、中压分离系统、葡聚糖凝胶、制备液相等手段从该活性部分中分离到六个单体化合物。研究中分离到菹草中两个含量较高的次生代谢产物成份,鉴定为两个黄酮类黄酮苷化合物luteolin-3'-O-β-D-glucpyranoside (LU3'O-GP)和flavone-6-C-β-D-glucopyranoside (FL6C-GP)。评价了两种化合物对ES-2肿瘤细胞增殖,形态特征,细胞周期进程,细胞凋亡以及细胞迁移侵袭的影响作用,实验结果显示LU3'O-GP对ES-2肿瘤细胞的增殖,形态特征,迁移,侵袭,基质金属蛋白酶(MMPs)表达均有明显的抑制作用,而FL6C-GP对ES-2细胞则无明显的相应抑制作用。LU3'O-GP是实验中分离纯化获得的南四湖流域菹草含量最高的次生代谢组分,研究中发现了该化合物对ES-2肿瘤细胞显著的迁移及侵袭抑制活性,揭示了其在医药健康领域潜在的利用价值,同时进一步证明了本研究提出的南四湖流域基于高附加值天然产物筛选的人工湿地植物资源化思路的可行性。综上所述,本研究基于抗肿瘤活性天然产物对南四湖流域人工湿地植物资源化进行研究,通过初步筛选后对两种典型人工湿地植物进行了抗肿瘤活性筛选,从多个方面对抗肿瘤活性进行评价,对植物代谢产物活性成份进行了分离纯化,并探讨了其抗肿瘤活性机制。本研究为南四湖流域湿地植物高附加值资源化利用提供了新的思路,初步探讨并证明了该利用途径的可行性。
【关键词】：南四湖 人工湿地植物 资源化 天然产物 抗肿瘤 黄酮苷
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q948;X52
【目录】：

• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 第一章 前言17-34
• 1.1 研究背景17-18
• 1.2 相关概念18-21
• 1.2.1 湿地18-19
• 1.2.2 湿地修复重建19-20
• 1.2.3 人工湿地20-21
• 1.3 湿地植物资源开发利用研究进展21-24
• 1.3.1 人工湿地植物21-23
• 1.3.2 南四湖湿地植物资源开发利用23-24
• 1.4 植物活性天然产物资源24-32
• 1.4.1 天然产物研究概述24-27
• 1.4.2 植物天然产物资源种类27-30
• 1.4.3 植物天然产物抗癌研究30-32
• 1.5 研究目的及意义32-34
• 第二章 研究区域与方法34-40
• 2.1 南四湖流域及新薛河人工湿地概况34-38
• 2.2 调查地点及方法38-40
• 第三章 人工湿地优势种植物资源抗肿瘤活性筛选40-53
• 3.1 植物材料准备40-41
• 3.2 实验仪器材料及方法41-45
• 3.2.1 实验仪器及试剂41-42
• 3.2.2 植物总次生代谢产物提取42-43
• 3.2.3 植物提取物抗肿瘤活性实验43-44
• 3.2.4 空心莲子草提取物高效液相分析44-45
• 3.3 实验结果45-49
• 3.3.1 湿地植物提取物对肿瘤细胞PC3的抑制作用45-46
• 3.3.2 湿地植物提取物对肿瘤细胞U2OS的抑制作用46-47
• 3.3.3 空心莲子草幼苗提取物补充肿瘤活性实验47-49
• 3.4 讨论49-52
• 3.5 本章小结52-53
• 第四章 湿地植物荇菜抗癌活性筛选53-67
• 4.1 实验材料及方法53-57
• 4.1.1 植物材料53
• 4.1.2 实验仪器及试剂药品53-54
• 4.1.3 荇菜次生代谢产物提取及分离54-56
• 4.1.4 荇菜提取物高效液相分析56
• 4.1.5 荇菜提取物肿瘤细胞抑制活性实验56
• 4.1.6 荇菜提取物活性部分成份分析56-57
• 4.2 实验结果57-64
• 4.2.1 荇菜提取物液相分析结果57-59
• 4.2.2 荇菜提取物肿瘤细胞抑制活性评价59-61
• 4.2.3 荇菜提取物活性部分成份分析61-64
• 4.3 讨论64-66
• 4.4 本章小结66-67
• 第五章 湿地植物菹草的抗肿瘤活性筛选67-88
• 5.1 研究方法67-73
• 5.1.1 植物材料准备67
• 5.1.2 主要实验仪器及材料67-68
• 5.1.3 菹草次生代谢产物提取分离及鉴定68-70
• 5.1.4 肿瘤细胞培养70-71
• 5.1.5 菹草提取物对肿瘤细胞抑制活性评价实验71
• 5.1.6 菹草提取物对肿瘤细胞形态影响71
• 5.1.7 菹草提取物对肿瘤细胞细胞周期进程的影响71-72
• 5.1.8 菹草提取物肿瘤细胞凋亡实验72-73
• 5.1.9 菹草提取物对L929细胞迁移运动的影响73
• 5.2 实验结果73-81
• 5.2.1 菹草EtOAc提取物对ES-2,MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制作用73-76
• 5.2.2 菹草EtOAc提取物改变MDA-MB-231肿瘤细胞形态76-77
• 5.2.3 菹草EtOAc提取物阻滞MDA-MB-231肿瘤细胞细胞周期进程77-78
• 5.2.4 菹草EtOAc提取物诱导MDA-MB-231凋亡及坏死78-81
• 5.2.5 菹草提取物对L929细胞迁移能力的影响81
• 5.3 讨论81-86
• 5.4 本章小结86-88
• 第六章 菹草黄酮类化合物抑制肿瘤活性研究88-108
• 6.1 实验方法及材料88-94
• 6.1.1 主要实验仪器及试剂88-89
• 6.1.2 细胞增殖抑制测试89-90
• 6.1.3 细胞形态观测90-91
• 6.1.4 细胞周期分析实验91
• 6.1.5 细胞凋亡分析实验91
• 6.1.6 细胞迁移实验91-92
• 6.1.7 细胞侵袭实验92
• 6.1.8 细胞总RNA提取及RT-PCR实验92-93
• 6.1.9 细胞蛋白表达Western blotting实验93-94
• 6.2 实验结果94-103
• 6.2.1 菹草黄酮苷LU3'O-GP对ES-2肿瘤细胞的抑制作用94-95
• 6.2.2 菹草黄酮苷LU3'O-GP对ES-2肿瘤细胞形态的影响95-96
• 6.2.3 菹草黄酮苷LU3'O-GP对ES-2肿瘤细胞细胞周期的影响96-97
• 6.2.4 菹草黄酮苷LU3'O-GP对ES-2肿瘤细胞凋亡的影响97-99
• 6.2.5 菹草黄酮苷LU3'O-GP对ES-2肿瘤细胞迁移及侵袭的抑制作用99-103
• 6.3 讨论103-107
• 6.4 本章小结107-108
• 第七章 研究总结及展望108-112
• 7.1 研究总结108-110
• 7.2 研究创新点110-111
• 7.3 研究中的不足及展望111-112
• 参考文献112-131
• 致谢131-133
• 博士期间的学术成果133-134
• 附件134-143

【参考文献】

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本文编号：360195